Микрофлора организма человека

Микробы тела человека разнообразны и могут обитать на коже и слизистых оболочках, в полостях, сообщающихся с внешней средой. Несмотря на определенные колебания состава и количества микрофлоры по годам, временам года, времени суток, состоянию здоровья или навыкам личной гигиены, составу пищи и пр., на теле сформировалась постоянная микрофлора, которую называют автохтонной.

Из зубного налета можно готовить препарат "раздавленная капля" для обнаружения подвижных микроорганизмов.

Для бакисследований делают смыв с кожи руки тампоном, смоченным в изотоническом растворе хлорида натрия. Тампоном делают посев на чашки Петри. Выросшие колонии микроскопируют, пересевают на среду Эндо и на среду Сабуро.

Для исследования микрофлоры кишечника 1 г фекалий растирают в ступке с 9 мл физ. раствора. Из этого основного разведения делают посевы в рабочих разведениях на разные питательные среды для количественного определения кишечной микрофлоры.

На среде Блаурокки выделяют бифидобактерии, из разведений 10⁷, 10⁹, 10¹⁰. Для выделения лактобактерий делают посев на среду МРС, из разведений 10⁵, 10⁷. Энтерококки определяют при посеве на среду Калины, из разведений 10⁵, 10⁷. Стафилококки выявляют на среде ЖСА, из разведений 10³, 10⁵. Дрожжеподобные грибы высевают на среду Сабуро (кандиды), из разведений 10³,10⁵. Синегнойную палочку определяют посевом на малахитовый агар, из разведений 10¹, 10³, 10⁵, 10⁷. Клостридии выявляют посевом в столбик среды Вильсона, из разведений 10³.10⁵,10⁷. При появлении роста на чашках делают соответствующие пересевы для выделения чистой культуры. Результаты анализа вносят в бланк «Бактериологическое исследование кала на дисбактериоз», напротив соответствующих родов микробов.

Приводим нормальные показатели микрофлоры кишечника по родам и группам.

Название микроорганизмов	Норма
	у взрослых	у детей до 1 года
Бифидобактерии	108-1010	109-1010
Бактеройды	109-1010	108
Молочнокислые бактерии	105-107	106-108
Спороносные анаэробны	105	0
Эшерихии: с нормальной ферментацией, со сниженной ферментацией, лактозонегативные	107-108 106-107 106-107	107-108 107-108 106-107
Гемолизируюшие кишечные палочки	0	0
Протей	104	105
Другие УПЭ	105	104
Энтерококки	105-106	105-107
Стафилококки: золотистый, эпидермальный, сапрофитный	102 104	102 104-106
Дрожжеподобные грибы	104	104
Патогенные бактерии семейств кишечныхх	отсутствуют	отсутствуют

Инфекционный процесс

Инфекционный процесс в восприимчивом организме человека возникает после воздействия на него различными факторами патогенности микроорганизмов. Это могут быть разнообразные ферменты, токсины, белки, поверхностные вещества, капсула и пр. Организм защищается и противодействует факторам патогенности и самому микроорганизму своими многочисленными факторами иммунного ответа и общего действия: например, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, антитела, фагоциты, система комплемента, медиаторы, секреты слизистых, интерферон и пр.

Рассмотрим некоторые из факторов защиты организма человека.

Фагоцитоз - важный клеточный фактор общей резистентности организма. Поскольку фагоцит должен осуществлять ряд функций для проявления своей фагоцитарной активности, существуют разные методы определения фагоцитарной активности и наличия хемотаксиса.

Наработано несколько способов определения активности фагоцитов:

1. Выделенные нейтрофилы соединяют на предметном стекле с половинным по объему количеству грибов Candida albicans. Затем фагоциты разрушают дезоксихолатом натрия (2,5 % раствор) и вносят 0,01 % раствор метиленовой синей для окраски грибов, потерявших жизнеспособность. Подсчитывают число убитых грибов.

2. Кровь из пальца в количестве 0,1 мл помещают на стерильное покровное стекло и выдерживают во влажной камере 45 мин при 45⁰ С, после чего сгусток удаляют пинцетом. Покровное стекло с прикрепленными к нему нейтрофилами промывают в растворе Хенкса, вносят к ним расчетную дозу грибов и стекло помещают во влажную камеру, клетками вверх на 30 мин при 45⁰ С. Затем стекло промывают в растворе Хенкса и высушивают. Препарат окрашивают по методу Романовского-Гимзе, подсчитывают фагоцитарное число - процент фагоцитов, поглотивших грибы, фагоцитарный индекс - среднее число поглощенных частиц на 1 фагоцит.

3. Определение кислородного метаболизма фагоцитов (НСТ-тест). Каплю крови из пальца помещают на предметное стекло, инкубируют во влажной камере 60 мин при 37⁰ С. Снимают эритроцитарный слой иглой, обводя по периметру и подцепив его. Предметное стекло заливают нитросиним тетразолием, инкубируют 20 мин при 37⁰ С и подсушивают. Фиксируют метанолом и красят 2 % раствором метиленовым зеленым 12-15 мин. Считают клетки с гранулами формазана. В активных фагоцитах бесцветный НСТ превращается в синий нерастворимый формазан.

Активность системы комплемента. Система комплемента играет важную роль в реализации воспалительных и иммунных реакций. Название комплемент – дано литической системе П.Эрлихом (1900).

Метод определения активности комплемента заключается в определении 50 % гемолиза - наибольшем разведении комплемента, обеспечивающем гемолиз 50 % взвеси эритроцитов.

Вначале создается гемолитическая система: смешивают равные объемы - 5 % взвеси нативных эритроцитов барана и гемолитической сыворотки в трехкратной концентрации (в концентрация, в три раза выше, чем титр). Выдерживают 30 мин при 37⁰ С и отмывают от свободных антител и других элементов сыворотки. Гемсистему (осадок эритроцитов барана, нагруженных антителами гемолитической сыворотки) ресуспендируют до 5 % взвеси.

Исследуемую сыворотку в разведении 1:10 разливают: в первую пробирку в объеме 0,05 мл, во вторую - 0,1 мл, в третью - 0,15 мл, в четвертую - 0,20 мл, в пятую - 0,25 мл, в шестую - 0,30 мл, в седьмую - 0,35 мл, в восьмую - 0,40 мл, в девятую - 0,45 мл, в десятую - 0,50 мл.

Вносят в пробирки 0,85 % раствор хлорида натрия до 1,5 мл в каждую пробирку, т.е. в первую -1,45 мл, во вторую - 1,4 мл и т.д. Затем в каждую из этих пробирок вносят по 1,5 мл гемолитической системы и инкубируют 45 мин при 37⁰ С. Степень гемолиза измеряют на ФЭК или делают предварительно 10 пробирок с разной степенью гемолиза равной взвеси эритроцитов: первая пробирка - 100 % гемолиз, вторая - 90 %, третья - 80 % и т.д. до 10 % гемолиза. Сравнивая пробирки, определяют 50 % гемолиз в опытном ряду.

Лизоцим Один из факторов общей резистентности организма. Фермент, оказывающий бактерицидное действие на кокковую микрофлору. Определение активности этого фермента проводят следующим образом. В 5 пробирок вносят 0,9 мл 0,85 % раствора хлорида натрия, а затем в первую пробирку вносят 0,1 мл лизоцима в разведении 1:10, перемешивают, после чего готовят 10-кратные разведения, путем переноса 0,1 мл раствора лизоцима из первой пробирки во вторую, после перемешивания, переносят 0,1 мл в третью и т.д. до разведения 1: 10000 (четвертая пробирка). Пятая пробирка - контроль (не содержит лизоцима). Во все пробирки вносят по 0,5 мл 1 млрд взвеси Micrococcus lisodeiecus или другой микроб. Смесь перемешивают и инкубируют в термостате при 37⁰ С в течение 3 ч. Отмечают наибольшее разведение лизоцима, вызвавшее лизис микробов.

Метод Манчини (определение сывороточных иммуноглобулинов). На ровной плоской поверхности (стеклянная пластина, крышка от пластины для иммунологических реакций) создают слой геля, толщиной 1-2 мм, содержащий антисыворотку к определенному классу ИГ человека.

В геле штампуют лунки, которые затем заполняют испытуемыми сыворотками человека для определения количества иммуноглобулинов.

Пластины оставляют на 2-5 дней и учитывают результат. Молекулы иммуноглобулинов диффундируют в геле во все стороны и в месте оптимальной концентрации образуют кольцо преципитации - как результат реакции с антисывороткой. Диаметр кольца преципитации должен соответствовать количественному содержанию ИГ в исследуемой сыворотке.

Специальной линейкой измеряют наибольший диаметр кольца преципитации, а затем по таблицам определяют количество ИГ в исследуемой сыворотке. В норме содержание ИГ в сыворотке колеблется в пределах: IgM - 0,65-1,65 г/л, IgG - 7,50-15,45 г/л, IgA - 1,25-2,50 г/л.

РТМЛ – реакция торможения миграции лейкоцитов. РТМЛ основана на феномене подавления миграции лейкоцитов фактором, который выделяют сенсибилизированные лейкоциты при взаимодействии с чужеродным агентом.

Силиконизированные капилляры заполняют взвесью лейкоцитов крови, вводят в них клетки «чужака», центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об. в мин, затем отламывают конец капилляра, не содержащего осадка клеток. Бактерии, вирусы и пр. агенты добавляют или в суспензию лейкоцитов или в инкубационную камеру. Капилляры помещают в камеру с питательной средой 199 и инкубируют при 37^о С в течение 18-24 ч. Лейкоциты мигрируют из капилляра и образуют зону помутнения в среде. Площадь зоны помутнения проецируют на бумагу. Вычисляют индекс подавления миграции лейкоцитов агентом в сравнении с контрольной миграцией лейкоцитов без агента.

РБТЛ –реакция бласттрансформации лимфоцитов. Реакция основана на феномене активации лимфоцитов под влиянием стимула (митогена), с трансформацией их в бласты – большие делящиеся клетки. Этим определяется пролиферативная потенция лимфоцитов.

Свежую гепаринизированную кровь человека в количестве 0,6 мл разводят в 5 раз средой Игла с добавлением 20 мл (в концентрации 80 мкг/мл) глутамина и вносят по 100 мкл вместе с митогеном в 96-луночные планшеты для иммунологических реакций. В качестве мутагена можно использовать лаконос (PWM) в концентрации 5 мг/мл. Планшеты оставляют совместно с СО₂ при 37⁰ С на 72 ч, но за 16 ч до окончания инкубации вносят 5 мкг Ки/мл ³Н-тимидин. После завершения культивирования, клетки снимают с помощью харвестра на нитроцеллюлозные фильтры.

Уровень бласттрансформации лимфоцитов оценивают по интенсивности включения тимидина с помощью счетчика и жидкостного сцинцилятора и выражают в импульсах в мин. Индекс стимуляции рассчитывают из соотношений показателей митогениндуцированной и спонтанной бласттрансформации лимфоцитов.

Цитотоксический тест лимфоцитов. Лимфоциты периферической крови способны разрушать in vitro клетки-мишени как сенсибилизированные, та и не сенсибилизированные антителами. Это свойство лимфоцитов используют для оценки киллерной активности.

1. Оценка активности К-клеток. В качестве клеток-мишеней в данном тесте применяют эритроциты барана. К 0,1 мл 0,5 % взвеси нативных эритроцитов барана добавляют 0,01 мл суспензии лимфоцитов и инкубируют 3-4 ч при 37^о С. Далее смесь центрифугируют при 500 об. в мин в течение 10 мин. Супернатант удаляют. Цитотоксическую активность определяют по выходу гемоглобина из лизированных клеток. К супернатанту добавляют 0,2 мл бензидина и 0,2 мл 3 % Н₂О₂. Далее на спектрофотометре определяют оптическую плотность жидкости.

2. Оценка активности естественных киллеров (NK-клеток). В качестве клеток-мишеней берут опухолевые клетки. В ячейки круглодонной пластины помещают 1-2^. 10⁴ меченых клеток-мишеней, к ним добавляют лимфоциты – 1-1,5^.106 клеток в мл. Смесь инкубируют при 370 С в течение 4-14 ч. Активность естественных киллеров определяют по выделению в надосадок радиоактивного изотопа.

3. Цитотоксический тест. Можно установить факт присоединения антител к клеткам с помощью определения жизнеспособности клеток в цитотоксическом тесте.

В лунки панели типа Такачи для микротитрования вносят суспензию клеток, сыворотку к ним и комплемент. Инкубируют смесь при 37^о С в течение 40 мин. Затем проводят окраску клеток трепановым синим, фиксируют их формальдегидом, переносят каплю смеси на предметное стекло и с использованием светового микроскопа определяют количество клеток, потерявших жизнеспособность, т.е. окрашенных. По сути – это реакция прямого гемолиза.

Определение ЦИК (циркулирующих иммунных комплексов). Сыворотку крови разводят 0,85 % раствором хлорида натрия 1 :25, смешивают с 7 % взвесью ПЭГ (полиэтиленгликоля) 1:1. Пробирки помещают в холодильник на 18 ч, затем центрифугируют 15 мин при 1500 об в мин, удаляют супернатант, а осадок растворяют в 2,5 мл 0,1 н раствора NaOH, тщательно его перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Пробы замеряют на спектрофотографе с длиной волн 280 нм против 0,1 раствора NaOH. Уровни ЦИК выражают в ЕОП (единице оптической плотности). Уровни ЦИК в норме не должны превышать 0,110 ЕОП.

Второй способ. На культуре клеток линии Raji находятся рецепторы к С3 компоненту комплемента. При добавлении исследуемой пробы к этим клеткам иммунный комплексы, связанные с С3 компонентом будут фиксированы на клетках. Они выявляются с помощью меченых ферментом кроличьих антител к иммуноглобулинам сыворотки человека (по типу ИФА).

Определение поверхностных СD-антигенов

Реакция широко применяется, например, при обследовании ВИЧ-инфицированных, в диагностике иммунодефицита и пр. Разработаны разные модификации определения CD- антигенов. В основе метода лежит определение специфических маркеров лимфоцитов и других клеток, с помощью моноклональных антител. Например, Т-лимфоциты содержат СD3+, Т-хелпер (Т-индуктор) СD4+, Т-киллер и Т-супрессор СD8+, В-лимфоциты СD19+ и т.д.

Применяют моноклональные антитела, получаемые при слиянии миеломных клеток с плазматическими клетками, к одному из маркеров клеток. Полученные моноклональные антитела к одному из СD-антигенов, метят флюооресцеином, например, изотиоционатом, антитела к другому СD-антигену метят фикоэритритом. Смешивают такие моноклональные антитела с лимфоцитами и мазок помещают в люминисцентный микроскоп. Под действием света с длиной волны 488 нм первый краситель излучает зеленый цвет, а второй – оранжевый цвет. Возможно применение нового флюорохрома перидинина, излучающего красный цвет. Используя три флюорохрома возможно одновременное определение трех разных СD-антигенов в люминисцентном микроскопе.

Факторы патогенности микроорганизмов

Основными факторами патогенности являются многочисленные токсины и ферменты. Приводим некоторые методы определения этих патогенных факторов.

Токсины. Это активные в биологическом, антигенном, токсигенном и др. действиях факторы патогенности многих микроорганизмов. Токсины (греч. toxicon - яд) бывают двух типов: экзогенные (собственно токсины) и эндогенные.

1. Определение летального токсина.

а) Культуру, например, стафилококка штамма Кован засевают на чашку Петри с агаром, приготовленным по методу Париш и Кларка (агар, разведенный мартеновским бульоном поровну). Чашки помещают в эксикатор (с 20 % содержанием СО₂), далее - в термостат на 24 ч при 37⁰ С. После инкубации наливают еще 10 мл мартеновского бульона и выдерживают еще сутки. Затем содержимое чашки фильтруют через марлю, потом свечи Шамберлана или фильтр Зейтца.

б). Определяют летальность токсина, вводя его лабораторным животным (кролики и пр.) внутривенно по 0,1-0,5 мл фильтрата в разных разведениях стерильной дистиллированной водой. Определяют DLV50 (дозу летальности 50 %), когда от определенной дозы токсина гибнет 50 % опытных животных.

2. Определение токсигенных свойств C.diphtheriae.

Расплавляют агар Мартена при 90^о С в водной бане.

Охлаждают до 50⁰ С и добавляют 20 % сыворотки крови КРС. Смесь перемешивают и выливают в чашку Петри, давая ей равномерно растекаться по дну чашки. В центр чашки на застывающий агар обожженным пинцетом накладывают бумагу фильтровальную, заранее пропитанную сывороткой антитоксической противодифтерийной.

Подсушивают чашку в термостате 15-20 мин, затем переворачивают вверх дном

Затем на чашку засевают культуру в виде бляшек, диаметром 0,6-0,7 см, на расстоянии 0,7-0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку наносят не более 10 бляшек разных культур, из них 4- контрольные, три - tox+ и одна - tox- культуры.

После экспозиции 2-4 суток, наблюдают следующие виды результатов:

1. Испытуемые культуры являются токсигенными, если их линии преципитации могут сливаться с другими культурами положительными и контролем (+).

2. Используемые культуры нетоксигенные, если линии их преципитации не сливаются с линиями, образованными положительными культурами и (+) контролями, они могут даже перекрещиваться с линиями специфическими.

3. Некротические свойства токсина. Делают разведения фильтрата от 1:20 до 1:10240 на дистиллированной воде.

Вводят кролику по 0,2 мл фильтрата. Токсин средней силы при этой пробе вызывает образование некроза в разведении 1:1200 через 24-48 ч.

Мышам вводят по 0,1 мл столбнячного токсина. Через 24-48 ч появляются признаки поражения центральной нервной системы, выражающиеся в спастических сокращениях отдельных мышечных групп, а затем гибели мышей от паралича дыхательных мышц.

4. Определение гемолитической активности токсина. Готовят ряд последовательных разведений токсина на 0,85 % растворе хлорида натрия, начиная с 1:10 и далее до 1: 10000. К 1 мл каждого разведения токсина добавляют по 1 мл 20 % взвеси нативных эритроцитов кролика, отмытых трижды изотоническим раствором хлорида натрия. В отдельную пробирку вместо токсина вводят растворитель. Пробирки ставят на 2 ч в термостат, затем на 2 ч при комнатной температуре, после чего учитывают результат. Полный лизис ++++, лизис почти полный +++, не полный лизис и значительный осадок на дне ++, лизис отсутствует (-).

Ферменты

1. Определение каталазы. На предметное стекло наносят 2 капли 3 % раствора перекиси водорода. В первую каплю платиновой петлей вносят культуру S.aureus и равномерно ее растирают круговыми движениями петли. После этого петлю прожигают и во вторую каплю вносят таким же образом культуру S.pyogenes. При наличие фермента каталазы - происходит расщепление перекиси водорода, что сопровождается выделением пузырьков газа (культура стафилококка). При отрицательной реакции расщепления перекиси водорода не последует - будут отсутствовать пузырьки газа (стрептококк - каталаза отрицательный).

2. Определение гиалуронидазы. В пробирку с культурой испытуемых бактерий вносят по 0,5 мл гиалуроновой кислоты и после экспозиции при 37⁰ С в течение 30 мин добавляют 2 капли 2 n раствора уксусной кислоты. Параллельно делают контроль без микробной взвеси. В контроле выпадает слизистый комочек. В опыте этого не происходит

3. Определение коагулазы. Свежую плазму крови разводят в 5 раз стерильным 0,85 % раствором хлорида натрия и разливают по 0,5 мл по стерильным пробиркам. В пробирку вносят 1 петлю агаровой суточной культуры исследуемого штамма и суспендируют в плазме. Во вторую пробирку вносят заведомо коагулазо (+) штамм и в третью пробирку - коагулазо (-) штамм и еще оставляют пробирку с незасеянной плазмой. Штатив помещают в термостат при 37⁰ С и регистрируют результат через 1, 2, 4, 18 ч инкубации.

Появление на дне 1-ой и 2-ой пробирок студнеобразного сгустка любого размера – есть положительный результат. Отсутствие свертывания плазмы через 18 ч можно расценивать как отрицательный результат.

4. Определение ДНКазы. К 100 мл расплавленного 1,8 % мясо-пептонного агара рН 8,6 добавляют раствор ДНК (50 мг, 100 мг или 200 мг высокополимерной ДНК растворяют в 3-5 мл дистиллированной воды, подщелоченной 4-5 каплями 2 М раствора NaOH) и прогревают среду 20 мин в кипящей водяной бане. Затем в слегка охлажденный агар вносят раствор 10 % стерильного CaCO₂ (0,5 мл) , перемешивают и разливают тонким слоем в чашки Петри.

Суточную агаровую культуру исследуемого штамма засевают короткими штрихами на поверхность подсушенного агара. На одну чашку можно засеять до 16 штаммов. После 18-24 ч инкубации при 37⁰ С поверхность агара заливают 5-8 мл 3 М раствора HCl. Через 2 мин кислоту сливают и регистрируют результат.

Появление вокруг культуры непрозрачной зоны (деполимеризация ДНК), которая в 4 раза превосходит по ширине зону микробного роста (2-3 мл зона роста) свидетельствует о положительной реакции на ДНКазу. Меньшая доза деполимеризации должна расцениваться как сомнительный результат.

5. Определение фосфатазы. Фенолфталеинфосфат натрия добавляют в концентрации 0,01 % к 100 мл расплавленного и охлажденного 1,8 % питательного агара, перемешивают и разливают в чашки Петри. Суточные агаровые культуры исследуемых штаммов засевают на чашку с помощью петли. Инкубируют в течение 18-24 ч при 37⁰ С. После инкубации на крышку чашки Петри наливают 5-6 капель 25 % раствора аммиака, выдерживают чашку в перевернутом виде на крышке 5-10 мин, подвергая культуру действию паров аммиака и регистрируют результат. О положительной реакции свидетельствует розовое окрашивание микроколоний.

6. Определение гемолизина. В чашки с кровяным агаром засевают методом бляшек исследуемую культуру бактерий. В эту же чашку засевают культуры заведомо tox+ и tox^- контроли. Чашку инкубируют в термостате при 37⁰ С в течение 18-24 ч. Затем проводят учет реакции, начиная с контролей. Наличие гемолизина у исследуемой культуры регистрируют по появлению вокруг бляшек зоны гемолиза - просветление кровяной среды.

Факторы адгезии Наличие у бактерий пилей - факторов адгезии выявляется в маннозочувствительных и маннозорезистентных реакциях гемагглютинации. В планшеты для микротитрования вносят 4 % взвесь отмытых эритроцитов человека, 1 % раствор D-маннозы и суспензию испытуемых бактерий в концентрации 10⁹ клеток в 1 мл. Каждый компонент добавляют в дозе 0,05 мл

Реакцию гемагглютинации учитывают как положительную, если в течение 30-60 мин происходит склеивание эритроцитов человека. Они оседают на дно лунок в виде широкого осадка, условно обозначаемого как «зонтик». Отрицательная реакция проявляется оседанием эритроцитов в виде маленькой «точки» или «колечка».

Иммунодиагностика

Иммунодиагностика - это определение возбудителя, его иммунологически активных дериватов или синтезированных в ответ на их внедрение факторов иммунного ответа организма, с помощью специфических иммунодиагностических препаратов.

Иммунодиагностические препараты, называемые просто диагностическими, бывают нескольких типов: антигенные, иммуноглобулиновые и антительные.

Антигенные диагностикумы - это диагностические препараты на основе микробов, либо вирусов, токсинов, грибов и пр. (микробо-вирусо-токсинные препараты), предназначенные для определения антител в прямых иммунологических реакциях либо антигена в непрямых.

Антительные диагностикумы - это диагностические препараты на основе глобулинов иммунных сывороток или антител, предназначенные для обнаружения антигена в прямых иммунологических реакциях или антител в непрямых.

Иммуноглобулиновые диагностикумы - это препараты на основе иммуноглобулинов нормальных сывороток, основанные на эффекторных свойствах молекулы ИГ. У ИГ на Fc- фрагменте есть рецепторы для связывания некоторых агентов, например, С3 компонента системы комплемента, белка А золотистого стафилококка, Т- и В- лимфоцитов, макрофагов и антител к иммуноглобулинам и пр. Эта связь осуществляется не по типу антиген-антитело, но бывает необходимым определять С-реактивный белок, проводить быструю индикацию стафилококка по белку А и пр. Для этих целей готовят иммуноглобулиновый диагностикум.

К настоящему времени разработано достаточно много как иммунореагентов, так и иммунологических реакций (более 200), требующих определенной систематизации.

Предлагаем нашу классификацию иммунологических реакций в сокращенном виде. При классификации иммунологических реакций необходимо уточнить: протекают они in vivo (в организме) или вне организма, в эксперименте (in vitro). Кроме того, иммунологические реакции должны быть поделены на клеточные - с участием лимфоцитов и гуморальные - с участием антител. Поэтому краткая (общая) схема иммунологических реакций может быть проиллюстрирована следующим образом:

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

протекающие in vivo. воспроизводимые in vitro

(реакции иммунитета) (иммунодиагностические)

гуморальные клеточные серологические клеточные

В данном разделе нас интересуют серологические реакции, воспроизводимые in vitro. Полная схема иммунологических реакций представлена в монографии В.А. Шамардина и др. (1989). Иммунологические реакции делятся нами по основному признаку: протекающие по типу антиген-антитело или по эффекторному типу. В данном разделе нас интересуют те реакции, которые протекают по типу антиген-антитело. Их следует различать по феномену, визуализирующему взаимодействие иммунореагентов (например, феномен агглютинации и пр.).

Реакции, основанные на определенном феномене, целесообразно делить на большие группы, имеющие общность характера взаимодействия (прямые, непрямые, осадочные, диффузионные и пр.) Такая схема отражена в таблице № 15 .

Таблица № 15.

Иммунодиагностические реакции, воспроизводимые in vitro

Феномены иммунодиагностических реакций
Агглютинации	Потребления комплемента	Иммунофлюо-ресценции	Преципитации	Нейтрализации	Иммуноконъю- гации
группы иммунодиагностических реакций
а. прямые б. непрямые в.торможения г. сорбции	а.прямые б. непрямые в. торможения	а.прямые б.непрямые в.торможения	а. осадочные б. диффузионные	а. гашения действия б.нейтрализа-ции	а. прямые б.непрямые в. торможение

Иммунологические феномены

Феномен агглютинации. Феномен основан на взаимодействии антител и антигенов с образованием характерного осадка (агглютината). При этом не менее, чем один из реагентов должен находиться в клеточной форме или быть в форме клеточного диагностикума.

К прямому методу следует относить все варианты взаимодействия клеток с антителами (агглютинация бактерий, эритроцитов, клеток тканей человека и пр.). К прямому методу относят разновидности РА микробов, агглютинации тромбоцитов, гемагглютинации и пр.

К непрямому методу относят все варианты взаимодействия антигена и антител, когда один из них находится в форме диагностикума (латексного, эритроцитарного, ализаринового, бентонитового, угольного и пр.). Непрямой метод составляют двухкомпонентные реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), варианты Ко-агглютинации, определение антигена в сорбированном виде (РОСА) и пр.

К методу торможения относят сложные многокомпонентные реакции, первым этапом которых является нейтрализация предполагаемого в исследуемом материале растворимого агента антисывороткой (либо антител исследуемой сыворотки - антигеном), вторым этапом - визуализация этого взаимодействия путем введения в смесь гомологичных диагностикумов (антительных, во втором случае – антигенных либо взвесь бактериального диагностикума). Результатом многоэтапных взаимодействий будет агглютинат. К методу торможения относят реакции: задержка прямой агглютинации и гемагглютинации (соответственно, РЗА, РТГА), варианты торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА), подавления гемагглютинации непрямой (РПНГ), определения класса агглютинирующих антител (РОКА) и др.

К методу определения специфически сорбированного агента относятся сложные и многокомпонентные реакции, первым этапом которых является специфическое связывание антигена антительным диагностикумом (либо антител - антигенным диагностикумом), а вторым этапом - агглютинация комплекса антителами, во втором случае антигеном. К методу относятся реакции: непрямой метод Кумбса, определения гаптена (РОГ), угнетение непрямой гемагглютинации (РУНГА), реакция расклеивания эритроцитов (РРЭ).

Феномен потребления комплемента. Феномен основан на взаимодействии антител и антигена в присутствии комплемента

К прямому методу относят разновидности лизиса клеток при непосредственной реакции их с антителами в присутствии комплемента (бактериолиз, гемолиз, тромбоцитолиз и пр.).

К непрямому методу относят варианты лизиса нативных эритроцитов, нагруженных антигеном, за счет взаимодействия с антителами в присутствии комплемента. Непрямой метод представлен реакциями: непрямого бактериолиза (бактерии нагружены вирусом) и непрямого гемолиза (эритроциты нагружены антигеном).

К методу с индикаторной системой относят большую группу многокомпонентных, двух- или многосистемных реакций, основанных на лизисе индикаторных клеток. В качестве этих индикаторных клеток обычно используют гемолитическую систему (нативные эритроциты барана, нагруженные гемолитической сывороткой). Первым этапом является взаимодействие растворимых антигена и антител (один из компонентов находится в исследуемом материале) в присутствии комплемента. Второй этап - внесение индикаторной системы, по состоянию которой (лизис эритроцитов или нет) судят о наличии в исследуемом материале антител (или антигена). Метод составляют реакции: Борде-Жангу, потребления комплемента (РПК), варианты связывания комплемента (РСК) - в жидкой фазе и на плотной среде (в геле).

К методу торможения относят также группу реакций, на первом этапе которых проходит адсорбция комплемента комплексом антиген-антитело, что регистрируется на втором этапе, путем внесения клеточного антигена (торможение прямого метода) или диагностикума на нативных эритроцитах (торможение непрямого метода) либо гемсистемы на нативных эритроцитах барана. К методу относятся: реакция нейтрализации лизиса микроба (РНЛМ), торможения непрямого гемолиза (РТНГем), подавление связывания комплемента (РПСК).

Феномен иммунофлюоресценции. Феномен основан на взаимодействии клеток, адсорбированных на предметном стекле, с иммунными сыворотками, предварительно меченными флюоресцирующим красителем. Это приводит к характерному свечению комплекса при просмотре в люминисцентном микроскопе.

К прямому методу относят варианты непосредственного взаимодействия клеток (ткани, микробы и пр.) с мечеными антителами, например, реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФП), реакции иммунофлюоресценции в притертом препарате (РИФПП) и пр.

К непрямому методу относят варианты выявления взаимодействия комплекса антиген -антитело с помощью дополнительно внесенного меченого антительного диагностикума. К методу относятся реакции: целлюлозно-флюоресцирующих антител (РЦФА), иммунофлюоресценции непрямой (РИФН), иммунофлюоресценции с использованием бумажных дисков (РИФБД), иммунофлюоресценции комплемента (РИФК).

К торможению иммунофлюоресценции относят многокомпонентные реакции, которые основаны на конкуренции за взаимодействие с гомологичным антигеном меченых антител и антител исследуемой сыворотки - реакция тушения иммунофлюоресценции (РИФТ).

Феномен преципитации. Основан на взаимодействии растворимых молекул антигена и антител в жидкой фазе или в геле. Это приводит к образованию мелкодисперсного агрегата (преципитата).

К методам образования преципитата в жидкой фазе относятся реакции: пробирочная Крауса, кольцепреципитации Асколи, капилярной преципитации, флокуляции и различные осадочные реакции (Кана, Закс-Витебского и пр.).

Метод, основанный на взаимодействии растворимых молекул антигена и антител в геле, по принципу диффузии компонентов, составляют реакции: простая одномерная и двумерная диффузия, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и его модификации.

Феномен нейтрализации. Основан на регистрации реакции антител с патогенными агентами (микробами, вирусами и пр.) или с их токсинами. Это приводит к нейтрализации возбудителя или его болезнетворного действия на организм.

Метод иммобилизации представлен реакциями: иммобилизации трепонем, иммунного прилипания, иммобилизации холерного вибриона, ингибиции метаболизма микробов.

Метод гашения болезнетворного действия составляют: нейтрализация инфекционного действия (на животных, куриных эмбрионах и культурах тканей) с учетом результатов их взаимодействия по летальности, бляшкообразованию, гемагглютинации, гемолитическим свойствам токсина, некротическом действии токсина и пр.

Феномен иммуноконъюгации. Основан на взаимодействия растворимых антигенов и антител на твердой фазе. Обнаружение комплекса проводят по определению метки.

По природе метки феномен составляют несколько семейств: радиоиммунный (РИА), иммуноферментный (ИФА), иммуномагнитный (ИМА), иммуноспектральный (ИСА) и др.

К семейству радиоиммунных реакций относятся: варианты радиоиммунного анализа (РИА), иммунорадиометрического анализа (ИРМА), радиосорбционные тесты (РИСТ и РАСТ), твердый сэндвич-радиоиммунный тест (ТСРИТ) и др.

К семейству иммуноферментных реакций относятся: метод ферментативного усиления (МФУ), иммуносорбентный метод со связанным ферментом (ЕLISА), варианты сэндвич-иммуноферментного анализа (ТСИФА) и пр.

В свою очередь эти большие группы реакций следует дополнительно делить на прямые, непрямые и торможения (конкурентные пробы).

Разновидности иммунологических реакций

В данном разделе мы не в состоянии показать весь массив иммунодиагностических реакций, которых на сегодня более 200. Приводим выборочно реакции, в соответствии с систематикой (по одной или нескольким реакциям, практически по всем группам всех феноменов).

Феномен агглютинации

Прямой метод. Это процесс взаимодействия гомологичных антител и клеток (тканей, микроорганизмов, эритроцитов, тромбоцитов и пр.) с последующим выпадением комплекса в осадок (агглютинат).

Для постановки РА-реакции агглютинации необходимо:

1. Растворитель- 0,85 % раствор хлорида натрия.

2. Известную 2 % бактериальную взвесь.

3. Исследуемую сыворотку.

4. Предметные стекла, бактериологические петли, спиртовку.

5. Исследуемая культура.

6. Наборы агглютинирующих сывороток. Реакция агглютинации ставится в двух вариантах: в развернутом виде в пробирках и в виде ориентировочного метода – капельно на предметном стекле.

1. Развернутый вариант РА.

В настоящее время реакция не применяется.

2. Капельный вариант РА.

Применяют для быстрого определения антител в сыворотке крови путем постановки РА на предметном стекле при известном диагностикуме или типировании чистой культуры микробов при известной антисыворотке.

Типирование культуры: на предметное стекло наносят каплю известной сыворотки в разведении 1:10 (или по инструкции) и отдельно - каплю растворителя. В первую каплю вносят бактериальной петлей типируемую культуру микроба и распределяют ее по капле.

Петлю прожигают на спиртовке и вновь набирают культуру, распределяя ее во второй капле. Петлю прожигают и ставят на место. Через несколько минут проводят учет результатов.

Если типируемая культура гомологична по специфичности антителам в сыворотке, то будет наблюдаться агрегация, т.е. образование в капле хлопьев – это положительный результат.

При определении антител, также делают две капли: одна из исследуемой сыворотки, а вторая – 0,85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле бактериального диагностикума (1 млрд взвесь). Через несколько минут будет проявление результатов ориентировочной РА. В случае присутствия в исследуемой сыворотке антител, которые гомологичны диагностикуму, будет наблюдаться хлопьеобразование (это положительный результат). При отрицательном результате (отсутствие антител в исследуемой сыворотке) обе капли остаются равномерно мутными.

Непрямой метод. Ввиду значительного многообразия диагностикумов (латексных, эритроцитарных, Ко-, и др.), их необходимо классифицировать.

Различия диагностикумов определяются природой иммунологически активного агента, нагруженного на нерастворимый носитель.

Диагностикумы

иммуноглобулиновые антительные антигенные

белковые небелковые

Диагностикумы предназначены для выявления антигена и определения антител в различных выделениях человека, а также в биологических жидкостях с помощью простых и сложных иммунологических реакций.

1. РНГА - реакция непрямой гемагглютинации.

Для постановки реакции необходимо иметь:

1. Диагностический препарат.

2. Растворитель - 0,85 % раствор хлорида натрия, содержащий 2 % фосфатного буфера, рН 7,2 и нормальную лошадиную сыворотку в объеме 0,4 %.

3. Полистироловые панели, микропластины типа Такачи, градуированные пипетки, колбы, флаконы, пробирки, штативы.

4. Инактиватор для исследуемых сывороток.

5. Формалинизированные эритроциты барана, 50 % взвесь.

Постановка РНГА. Это двухкомпонентная реакция, осуществляется в 2 вариантах: в полистироловых панелях (макровариант), в микропластинах типа Такачи (микровариант).

1. Макровариант.

Постановка реакции осуществляется в 2 этапа.

1 этап. Готовят как обычно последовательные разведения сыворотки крови пациента в объеме 0,5 мл в лунках полистиролового планшета. Для этого во все лунки одного ряда планшета вносят растворитель по 0,5 мл, а в первую лунку 0,5 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:50. Из первой лунки 0,5 мл смеси переносят во вторую лунку, перемешивают и 0,5 мл переносят в третью и т.д. Последнюю лунку оставляют контрольной (без сыворотки). Сыворотку можно переносить пипеткой или дозатором на 0,5 мл.

2 этап. Антигенный эритроцитарный диагностикум (АЭД) добавляют во все лунки по 0,5 мл 0,5 % взвеси или по инструкции. Учет результатов через 1,5- 2,0 ч (см. таблицу № 17).

2. Микрометод. Готовят последовательные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,05 мл в микропланшете типа Такачи, как указано раньше. Перенос 0,05 мл по лункам осуществляется дозатором или смесителем с объемом головки на 0,05 мл. Последняя лунка - контроль. Во все лунки вносят по одной капле (0,025 мл) 0,5 % диагностикума. Учет реакции гемагглютинации через 1,5- 2,0 ч.

В первом и во втором случаях вместо исследуемой сыворотки можно титровать другой исследуемый материал - на антиген (копроэкстракт, мочу и пр.), а добавлять антительный эритроцитарный диагностикум (АТЭД).

Таблица № 17.

Схема постановки развернутого варианта РНГА

Ингредиенты	Номера лунок и количество ингредиентов, в мл
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Исследуемая сыворотка, 1:50	1,0	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Растворитель	-	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Полученные разведения	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:6400	1:12800	-
АЭД, 5 % взвесь	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0.025	0,025	0,025	0,025	0,025
Результат РНГА	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	+	-	-
Титр РНГА	Титром РНГА является разведение сыворотки 1:3200

В первом и во втором случаях вместо исследуемой сыворотки можно титровать другой исследуемый материал - на антиген (копроэкстракт, мочу и пр.), а добавлять антительный эритроцитарный диагностикум (АТЭД).

Результаты РНГА учитывают по следующей схеме:

1. Агглютинат на ++++. Эритроциты покрывают все дно лунки широким "зонтиком".

2. Агглютинат на +++. Эритроциты покрывают почти все дно лунки.

3. Агглютинат на ++. Осадок небольшой, в центре лунки.

4. Агглютината на дне нет или он в виде маленькокого колечка. Это отрицательный результат.

Агглютинат в виде зонтика получается при положительном результате, когда антитела исследуемой сыворотки вступят в реакцию с антигенным диагностикумом. Если в сыворотке антител нет, то во всех лунках будет отрицательная реакция в виде маленького колечка.

С помощью РНГА можно определять до 15 тыс клеток (чумный микроб), до 1 млн клеток (эшерихии, протей и пр.) и более микробных тел или от 0,01 до 0,0001 мкг в мл растворимого антигена. Недостаток метода: из всей массы активных антител или антигенов определяется только их часть, так называемые полноценные или агглютинирующие. РНГА разработали в 1945 г. Миддлебрук и Дюбо.

Капельную постановку РНГА проводят в соответствии с описанной для РА, исключая типирование, диагностикум применяют не бактеральный, а АЭД.

Реакция Ко-агглютинации (РКоА).

Известна возможность поверхностного белка А золотистого стафилококка штамма Covan 1 соединяться с сайтом на Fc-фрагменте IgG человека, морской свинки и др. При этом Fab-фрагменты IgG с активным центром антител является свободным и доступным для взаимодействия с микробами, токсинами и пр. Таким образом, получают направленный антительный диагностикум, поскольку в остальных случаях приготовления диагностикумов антитела будут располагаться на носителе неупорядоченно.

Суточную культуру штамма Covan 1 смывают с агара 0,85 % раствором хлорида натрия и дважды отмывают путем центрифугирования при 3000 об. в мин в течение 15 мин, доводя взвесь бактерий до 10 %. Фиксируют и убивают клетки путем кипячения 1 мин.

К объему 10 % взвеси стафилококка добавляют равный объем иммунной сыворотки в разведении 1:20, специфичной к определяемому агенту в исследуемом материале (например, шигеллам зонне), истощенной (адсорбируемой) взвесью стафилококка сапрофита, с целью удаления антистафилококковых антител. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и дважды отмывают при центрифугировании. Осадок стафилококка следует ресуспендировать, а затем консервировать азидом натрия до 0,1 %. Таким образом, был приготовлен антительный Ко-диагностикум.

На предметное стекло наносят две капли: первая капля - это испытуемый на шигеллы зонне копроэкстракт, а вторая капля – 0,85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле приготовленного Ко-диагностикума. В течение 40-60 сек появляются хлопья (это положительная реакция в случае присутствия в материале шигелл зонне). В контроле будет равномерная муть. В случае отсутствия шигелл зонне (в нашем примере), то в опыте будет такая же равномерная мелкодисперсная муть, как и в контроле.

Торможение метода. Это сложные двухэтапные, многокомпонентные реакции.

РТГА - реакция торможения гемагглютинации.

Эта реакция относится к торможению прямой группы реакций, применяется в основном в вирусологии и также относится к феномену нейтрализации, где она и будет описана.

РТБА - реакция торможения бактериальной агглютинации.

Реакция не применяется.

РТНГА 1 - реакция торможения непрямой гемагглютинации 1. (Синонимы: РНАг - если диагностикум антительный, РНАт - если диагностикум антигенный).

Метод выполняют в 4 этапа.

1 этап. Предварительно выбирают рабочую дозу антисыворотки, путем постановки обычной РНГА с АЭД. Определяют титр данной антисыворотки (максимальное разведение, дающее положительный результат с АЭД). В качестве рабочей дозы используют разведение, которое в 3-4 раза концентрированнее, чем титр РНГА.

2 этап. Готовят последовательные разведения исследуемого материала на антиген как обычно, в объеме 0,25 мл в количестве 6 лунок в полистироловых панелях, оставляя шестую лунку контролем для диагностикума. В контрольный ряд вместо исследуемого материала вносят растворитель.

3 этап. Затем во все лунки двух рядов вносят антисыворотку к предполагаемому антигену в объеме 0,25 мл в рабочей дозе. Смесь встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

4 этап. После экспозиции во все лунки добавляют по одной капле 5 % взвеси антигенного эритроцитарного диагностикума, гомологичного по специфичности антисыворотке. Панель встряхивают и оставляют на 1,5-2,0 ч при комнатной температуре. В случае присутствия в материале антигена происходит нейтрализация в лунки антител известной антисыворотки, где антиген еще в значительной концентрации. В этих лунках будет отрицательной реакцией (таблицы 18 и 19).

В последующих лунках будет превалировать антисыворотка, поскольку антиген уменьшается ввиду его разведений в лунках. Это должно проявиться положительной реакций (РНГА). При отсутствии антигена в материале все лунки будут положительными по РНГА.

В последующих лунках будет превалировать антисыворотка, поскольку антиген уменьшается ввиду его разведений в лунках. Это должно проявиться положительной реакций (РНГА). При отсутствии антигена в материале все лунки будут положительными по РНГА.

Таблица № 18.

Выбор рабочей дозы антисыворотки для РТНГА 1

Ингредиенты	Номера лунок и количество ингредиентов, мл
	1	2	3	4	5	6	7
Известная сыворотка 1:100	1,0	-	-	-	-	-
Растворитель		0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Полученные разведения	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200
АЭД, 5 %	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
Результат РНГА	++++	++++	++++	++++	++++	-	-
Титр РНГА и рабочая доза антисыворотки	Титром антисыворотки является разведение 1:1600, а рабочая доза – (1:1600):3 = 1:533.

Таблица № 19

Схема постановки РТНГА 1

Ингредиенты	Номера лунок и количество ингредиентов, в мл
	1	2	3	4	5	6
Растворитель	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Исследуемый на антиген материал, 1:10	0,25	-	-	-	-
Полученные разведения	1:20	1:40	1:80	1:!60	1:320
Антисыворотка в рабочей дозе	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
АЭД, 5 % взвесь	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
Результат РНГА	-	-	-	+++	++++	++++

РТНГА-2 (реакция торможения непрямой гемагглютинации).

1 этап. Готовят несколько идентичных рядов последовательных разведений известной антисыворотки в объеме 0,25 мл в полистироловых панелях. Количество рядов соответствует количеству проб на антиген и еше один - контрольный ряд.

2 этап. Во все лунки первого ряда вносят по 0,25 мл экстракта исследуемого материала на антиген, а во все лунки второго ряда - растворитель по 0,25 мл. Панели с лунками осторожно встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

3 этап. После этого во все лунки двух рядов вносят по одной капле 5 % взвеси АЭД, соответствующего по специфичности антисыворотке. Учет результатов проводят через 1,5-2,0 ч (таблица № 20).

В случае присутствия антигена в материале он нейтрализует антисыворотку и титр РНГА в первом ряду будет короче на несколько лунок, чем в контрольном ряду. В случае отсутствия антигена в материале титр РНГА в первом и во втором рядах будет идентичным.

Эти реакция (как и вся группа реакций метода) позволяет выявлять всю сумму антигена или антител, имеющих специфичность, в отличие от РНГА, где выявляются агенты, которые имеют только полноценные свойства.

Таблица № 20.

Постановка РТНГА-2

Ингредиенты 1 ряд лунок	Номера лунок и количество ингредиентов, мл
	1	2	3	4	5			6	7		8	9
1 ряд лунок
Антисыворотка	05	-	-	-	-			-	-		-
Растворитель	-	0,25	0,25	0,25	0,25			0,25	0,25		0,25	0,25
Разведения	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600			1:3200	1:6400		1:12800
Антиген 1:10	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25			0,25	0,25		0,25	0,25
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
АЭД, 5 %	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025			0,025	0,025		0,025	0,025
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
Результат РНГА	++++	++++	++++	+	-			-	-		-	-
2 ряд лунок
Растворитель		0,25	0,25	0,25	0,25			0,25	0,25		0,25	0,25
Антисыворотка	0,5	-	-	-	-			-	-		-
Разведения	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600			1:3200	1:6400		1:12800
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
АЭД, 5 %	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025			0,025	0,025		0,025	0,025
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
Результат РНГА	++++	++++	++++	++++		++++	++++		+++	-		-
Результат анализа	В материале есть антиген, на что указывает торможение РНГА в первом ряду на 4 лунки по сравнению со вторым рядом (титр РНГА 1 ряда 1:400, а второго – 1:6400)

Эти реакция (как и вся группа реакций метода) позволяет выявлять всю сумму антигена или антител, имеющих специфичность, в отличие от РНГА, где выявляются агенты, которые имеют только полноценные свойства.

При использовании антительного диагностикума возможно выявление антигена в РНГА и антител в сыворотке с помощью РТНГА. При использовании антигенного диагностикума возможно определять антитела в сыворотке при помощи РНГА и антигена в материале при помощи РТНГА. Это должно расширять ценность диагностикумов и выявляемость инфекционных больных.

Сорбционный метод. Составляют сложные многокомпонентные двухэтапные реакции.

РОГ - реакция определения гаптена.

1 этап. Готовят последовательные разведения (лучше в пробирках) исследуемого материала на антиген в объеме 0,5 мл на растворителе.

2 этап. Во все разведения вносят по 0,025 мл 0,5 % взвеси АТЭД . Смесь выдерживают 1,5-2,0 ч и учитывают результат. После учета реакции отбирают пробирки с отрицательной РНГА, отмывают антительный диагностикум в этих пробирках путем центрифугирования при 3000 об\ мин в течение 5 мин.

3 этап. К осадкам добавляют 0,5 мл иммунной сыворотки в рабочей дозе, по специфичности идентичной АТЭД. Результат учитывают через 1,5 - 2,0 ч.

В случае присутствия в материале неполноценного антигена, он будет реагировать с антительным диагностикумом, но не агглютинировать его. Внесение иммунной сыворотки резко изменит картину: взаимодействуя с неполноценным антигеном, сорбированном на диагностикуме, антитела добавленной иммунной сыворотки будут агглютинировать этот комплекс и будет получен положительный результат РНГА. Если неполноценного антигена (неагглютинирующего) в материале нет, то дополнительное введение иммунной сыворотки не приведет к агглютинации антительного диагностикума, т.е. РНГА будет отрицательной.

Метод разработан Ю.В. Канатовым (1984 г.) и имеет определенное значение при поиске чумного гаптена (неполноценного антигена) в заброшенных гнездах. В отличие от РНГА (выявляет полноценный антиген) и РТНГА (выявляет всю сумму антигена: полноценного и неполноценного), РОГ определяет только неполноценный антиген. Как видно, реакции не дублируют друг друга, но дополняют и расширяют диагностическую ценность методов и эритроцитарных диагностикумов.

Феномен потребления комплемента

Феномен составляют многочисленные реакции, объединенные одним принципом - лизис клеток с участием комплемента.

Прямой метод.

Реакции, основанные на лизисе клеток, достаточно многообразны и мы приводим одну.

РБЛ - реакция бактериального лизиса.

Метод не применяют.

Непрямой метод.

РНГем - реакция непрямого гемолиза.

Метод не применяют.

РСК - реакция связывания комплемента.

Для проведения реакции необходимо иметь:

1. Пробирки, штативы, пипетки, флаконы.

2. Растворитель - 0,85 % раствор хлорида натрия.

3. Исследуемая сыворотка крови.

4. Комплемент.

5. Взвесь нативных эритроцитов барана.

6. Антиген известной специфичности.

Это сложная многокомпонентная, четырехэтапная, двухсистемная реакция. Клетками- мишенями являются нативные эритроциты индикаторной (гемолитической) системы.

1 этап. Определение рабочего разведения гемолитической сыворотки (таблица № 21).

В пробирках делают последовательные разведения гемолитической сыворотки в объеме 0,5 мл. В эти же пробирки вносят 3 % взвесь отмытых нативных эритроцитов барана в

Таблица № 21.

Схема определения рабочего разведения гемолитической сыворотки

	Номера пробирок и количество ингредиентов, в мл
Ингредиенты	1	2	3	4	5	6	7	8
Гемсыворотка с 1:100	0,5	-	-	-	-	-	-
Растворитель	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Получаемые разведения	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:6400	1:12800
3 % взвесь эритроцитов	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Результаты РНГА	++++	++++	++++	++++	+++	+	-	-
Рабочее разведение гемсыворотки	Титром гемсыворотки является 1:1600, значит рабочим разведением является (1:1600):3=1:533

объеме 0,5 мл. Через 60 мин экспозиции учитывают результат РНГА.

Рассчитывают рабочее разведение сыворотки – это разведение гемолитической сыворотки, сконцентрированное в 3 раза от титра РНГА.

2 этап. Титрование комплемента.

Готовят ряд пробирок: в первую из них вносят 0,05 мл комплемента в разведении 1:10, во вторую - 0,1 мл комплемента, в третью - 0,15 мл, в четвертую - 0,2 мл, в пятую - 0,25 мл, в шестую - 0,3 мл, в седьмую - 0,35 мл, в восьмую - 0,4 мл, в девятую- 0,45 мл, в десятую - 0,5 мл. Одиннадцатая пробирка контрольная, которая содержит 0,5 мл растворителя.( таблица № 22).

Во все пробирки доливают растворитель до общего объема 0,5 мл, а затем вносят во все пробирки по 1 мл индикаторной системы и оставляют на 30 мин при 37 ^о С. После этого, все пробирки просматривают и выбирают наибольшее разведение комплемента, вызывающее гемолиз - это титр комплемента.

Таблица № 22.

Схема титрования комплемента (количество пробирок сокращено)

Ингредиенты	Номера пробирок и количество ингредиентов, мл
	1	2	3	4	5	6		7	8
Комплемент 1:10	0,05	0,06	0,07	0,08	0,09	0,1		0,14
Растворитель	0,45	0,48	0,49	0,4	0,48	0,5		0,42	0,5
Разведения	1:100	1:90	1:80	1:70	1:60	1:50		1:40
Гемсистема	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5		0,5	0,5
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
Результат	гемолиз	гемолиз	гемолиз	гемолиз	осадок		осадок	осадок	осадок
Рабочая доза комплемента	Титр комплемента составляет 1:70, значит рабочая доза комплемента: (1:70х30):100= 1:21

В реакцию берут разведение комплемента на 30 % выше, чем его титр, это рабочая доза комплемента.

3 этап. Приготовление индикаторной системы. К 3 % взвеси нативных эритроцитов барана добавляют равный объем гемолитической сыворотки в рабочем разведении. Смесь выдерживают 30 мин при 37^о С и осадок эритроцитов трижды отмывают растворителем при осаждении или центрифугировании при 500 об\мин в течение 10 мин. Осадок эритроцитов ресуспендируют до 3 % взвеси.

Постановка РСК. Титруют исследуемую сыворотку крови в пробирках от 1:50 до 1:12800 и делают контроли: на сыворотки (исследуемую, положительную и отрицательную), антиген, комплемент. Во все разведения сыворотки, кроме контроля сыворотки, вносят по 0,5 мл антигена. В контроль сыворотки, комплемента и антигена вносят по 0,5 мл растворителя. (таблица № 23).

Смесь встряхивают и во все пробирки добавляют по 0,05 мл комплемента в рабочей дозе. Смесь оставляют на 60 мин при 37^о С

После экспозиции в каждую пробирку вносят по 1,0 мл индикаторной системы. Смесь встряхивают и выдерживают 60 мин при 37^о С.

. При наличии в сыворотке гомологичных антител, комплемент расходуется на комплекс антиген-антитело первой системы. Это проявляется отсутствием лизиса индикаторных эритроцитов. При отсутствии антител в сыворотке комплемент не расходуется и тогда взаимодействует со второй системой (индикаторной). При этом эритроциты лизируются в первых пробирках.

Реакция связывания комплемента позволяет определять антитела, микробы, вирусы, растворимые антигены, однако он трудоемок и вытеснен при некоторых инфекциях другими методами.

Таблица № 23.

Схема постановки РСК

Дополнительные сведения Ингредиенты	Номера пробирок и количество ингредиентов, в мл
	1	2		3		4	5		6		7		8
	Разведения исследуемой сыворотки					Контроли
						сыворот- ка (+)		сыворот- ка (_ )		компле- мент		исслед. сывор.		антиген
Растворитель	0,5		0,5		0,5					0,5		0,5		0,5
Исслед. сыворотка 1:50	0,5		-		-							0,5
Разведения	1:100		1:200		1:400							1:100
Антиген	0,5		0,5		0,5	0,5		0,5		0,5		-		0,5
Комплемент	0,5		0,5		0,5	0,5		0,5		0,5		0,5		0,5
Заведомо отриц. сыв.								0,5
Заведомо полож. сыв.						0,5
Экспозиция 60 мин при 37о с
Гемсистема	1,0		1,0		1,0	1,0		1,0		1,0		1,0		1,0
Экспозиция 60 мин при 37о С
Результат РСК	осадок		осадок		осадок	осадок		гемолиз		гемолиз		гемолиз		гемолиз
Результат анализа	Исследуемая сыворотка содержит антитела, на что указывает осадок в первых пробирках с сывороткой и положительным контролем, при отрицательной реакции (гемолиз) в других контролях

Феномен иммунофлюоресценции

Объединяет большую группу методов и реакций, основанных на использовании свечения в люминисцентном микроскопе антител, меченых флюорохромом.

Непрямой метод.

РИФП - реакция иммобилизация прямая.

Для проведения реакции необходимо иметь:

1. Предметные стекла.

2. Иммунные сыворотки, меченые флюорохромом.

3. Антиглобулиновые сыворотки, меченые флюорохромом.

4. Исследуемый материал (микробы, культуры и пр.).

5. Растворитель - 0,85 % раствор хлорида натрия.

На обезжиренное предметное стекло делают мазки исследуемого материала или мазки-отпечатки. Препараты подсушивают, фиксируют смесью Никифорова. На мазок наносят иммунную сыворотку, специфичную в отношении предполагаемого в материале микроба, меченую флюорохромом. Препарат ставят во влажную камеру на 30 мин при 37^о С, а затем промывают в растворителе и ополаскивают в дистиллированной воде 10 мин, сушат при 18-20^О С и исследуют в люминисцентном микроскопе с иммерсионной системой.

Если микробы в мазке есть, то вокруг них будут скопления зеленого специфического свечения, а фон может равномерно слабо светиться. Это меченые антитела окружили гомологичную клетку. Оценку интенсивности специфического свечения ведут по 4-кресной системе: ++++ или +++ яркая флюоресценция, ++ и + слабая флюоресценция клеток.

Непрямой метод.

РИФН - реакция иммунофлюоресценции непрямая.

На обезжиренное предметное стекло наносят мазки из исследуемого материала или делают отпечатки из культур клеток или органов. Препарат подсушивают, фиксируют и наносят на мазок иммунную сыворотку, гомологичную по специфичности определяемому микробу. Препарат помещают во влажную камеру на 30 мин при 37^о С, затем хорошо промывают растворителем для удаления свободных компонентов сыворотки, ополаскивают в воде дистиллированной 10 мин, сушат при комнатной температуре и вносят меченую сыворотку против иммуноглобулинов иммунной сыворотки.

Эта видовая антисыворотка предварительно метится флюорохромом или используют коммерческую меченую антисыворотку.

Препарат помещают во влажную камеру на 30 мин при 37^о С, затем хорошо отмывают растворителем и прополаскивают дистиллированной водой, сушат и просматривают в люминисцентном микроскопе.

Если в исследуемом препарате содержится микроб, то с ним взаимодействуют антитела иммунной сыворотки и остаются фиксированными на мазке. Меченая антисыворотка будет взаимодействовать с Fc-фрагментами антител иммунной сыворотки и ее антитела также будут фиксированы на мазке. Это проявится специфическим свечением вокруг микробов. Если микробов нет, то антитела не фиксируются, характерного свечения не будет (результат отрицательный). При этом необходимы контроли: незараженный материал, гетерогенная культура, гомологичные микробы (положительный контроль). С помощью этого метода можно определять антитела в сыворотке при известном микробе в мазке.

Торможение метода.

РИФТ - реакция иммунофлюоресценции торможение.

На обезжиренное предметное стекло наносят два мазка-отпечатка или делают мазки из исследуемого материала. Их подсушивают, фиксируют и добавляют к опытному мазку одновременно иммунную сыворотку, специфичную к предполагаемому микробу, и вторую – эту же иммунную сыворотку, только меченую флюорохромом. В контрольный мазок вносят иммунную сыворотку, меченую флюорохромом. Препарат выдерживают 30 мин во влажной камере при 37^о С, отмывают и прополаскивают дистиллированной водой, просушивают и просматривают под люминисцентным микроскопом с иммерсионной системой.

Если в материале был микроб, то произойдет конкуренция меченых и немеченых антител за связывание с ним. Результатом их конкуренции будет снижение интенсивности специфического свечения в опытном мазке по сравнению с контролем, где одна меченая сыворотка. Если антигена нет, то свечение будет отсутствовать в обоих мазках.

Феномен преципитации

Это взаимодействие растворимых антигенов и антител с образованием агрегатов, что проявляется помутнением среды (образованием преципитата).

Осадочный метод.

Это реакции преципитации в растворе электролита, с медленно осаждающимся осадком (преципитатом).

РКПА - реакция кольцепреципитации Асколи.

Иммунную сыворотку в небольших разведениях (1:2-1:10) наливают в коническую пробирку в количестве 3-5 мл. По стенке этой пробирки пастеровской пипеткой осторожно наслаивают на сыворотку равный объем растворимого антигена (экстракт микробов). Для разведения ингредиентов применяют 0,85 % раствор хлорида натрия.

При наличии в материале антигена на месте встречи двух компонентов через несколько минут появляется помутнение - беловатое кольцо преципитата. Если антигена нет, то не будет и преципитата.

Эту реакцию широко применяют при определении сибиреязвенных бактерий на кожевенно-меховых изделиях. Кусочки кожи с мехом выстригают, измельчают, заливают растворителем 1:10 и кипятят 30 мин. Экстракт используют в РКПА для определения термоустойчивого сибиреязвенного антигена.

Диффузионный метод.

Эта группа реакций преципитации ставится в агаровом геле, результат взаимодействия растворимых антигена и антител проявляется в виде беловатой полоски на границе их встречи в геле - преципитат.

РПГ - реакция преципитация в геле.

Реакцию ставят на чашках Петри, залитых пептонным агаровым слоем. Посередине помещают полоску фильтровальной бумаги, предварительно смоченной антитоксической сывороткой. После подсушивания, на расстоянии 1 см от края полоски делают посевы культур дифтерийного микроба бляшками до 1 см, с двух сторон полоски бумаги. Среди культур должен быть заведомо токсигенный штамм (положительный контроль) и штамм нетоксигенный (контроль отрицательный). Посевы помещают в термостат на 24 ч.

Если культуры были токсигенные, то между полоской бумаги и бляшкой культуры возникает белая линия преципитации, которая совпадает с линией преципитации положительного штамма. Если культуры не токсигенные, то линии преципитации не будет. Преципитат образуется благодаря диффузии антител и антигена в разные стороны в агаре. В месте их встречи появится белая полоска преципитации.

РПО - реакция преципитации по Оухтерлоне.

Еще одна разновидность преципитации в геле. В агаре на чашке Петри определенными пробойниками вырезают 4 небольшие лунки, расположенных в виде квадрата, на расстоянии 0,5 см. В первую лунку вносят иммунную сыворотку. Во вторую лунку рядом - известный антиген (контроль положительный), гомологичный иммунной сыворотке, которая в 1 лунке. В третью лунку, напротив первой лунки, вносят нормальную сыворотку (отрицательный контроль). В 4 лунку, рядом с первой, но с другой стороны от нее по сравнению со второй лункой, вносят испытуемый на антиген экстракт. Чашка ставится во влажную камеру на сутки при 37^о С - при необходимости и более суток.

Если в испытуемом экстракте присутствует антиген, то полоски преципитации в геле распределятся между 1 и 2 лунками (контроль), 1 и 4 лунками (опыт) под углом к третьей лунке (отрицательный контроль). Если антигена нет, то будет всего одна полоска между 1 и 2 лунками (положительный контроль).

РИЭФ - реакция иммуноэлектрофореза.

Представляет собой сочетание электрофоретического разделения компонентов с иммунопреципитацией.

На стеклянную пластину наносят слой агара толщиной в несколько мм. В застывшем агаре проделывают небольшую лунку и вносят в нее исследуемый экстракт на антиген. Включают слабый ток и антиген начинает ускоренно двигаться в сторону анода, что и является электрофорезом. Движение антигена продолжается несколько часов. Затем поперек движения антигена прорезают узкую канавку и заполняют ее антисывороткой к антигену, предполагаемому в материале. Антитела сыворотки диффундируют во все стороны, в том числе - навстречу антигену.

Если в экстракте есть антиген, то наблюдаются белого цвета дуги преципитации, где произошло взаимодействие антиген-антитело. Пластину можно отмыть, окрасить на белки и сравнить со стандартом. Таким образом, если использовать известный антиген, можно определять антитела, а при известной антиглобулиновой сыворотке определять классы ИГ.

РВИЭФ - реакция встречного иммуноэлектрофореза.

Используется принцип движения компонентов реакции в электрическом поле. На стеклянной пластине, залитой агаром, делают лунки на расстоянии 1 см. В одну из них вносят экстракт на антиген, в другую - антисыворотку. Подключают слабый электрический ток. Антиген движется к аноду, а антитела - к катоду, т.е. навстречу друг другу. При этом методе происходит быстрое их сближение и реагирование (за 60 мин).

Если в экстракте есть антиген, то при встрече с антителами будет их взаимодействие, что проявится линией преципитации белого цвета. Пластину можно отмыть и покрасить для более четкого просмотра линий. Если антигена нет, линий преципитации не обнаруживается. В реакции нельзя использовать антигены, имеющие кислую реакцию.

Феномен нейтрализации

Основан на взаимодействии антител с микробами или его факторами метаболизма.

Метод иммобилизации.

Группа реакций основана на обездвиживании подвижных микробов.

РИТ - реакция иммобилизации трепонем.

В одну пробирку вносят 0,5 мл антисыворотки, предварительно прогретой при 56^о С в течение 15 мин, а во вторую пробирку- 0,85 % раствор хлорида натрия. В обе пробирки добавляют по 0,5 мл тканевой культуры хорошо подвижных трепонем. Пробирки слегка встряхивают и выдерживают 60 мин при 35^о С. Затем пастеровской пипеткой наносят на предметное стекло каплю из первой пробирки и из второй, раздельно. Накладывают покровные стекла и просматривают под микроскопом в темном поле. В первой пробирке будут наблюдаться обездвиженные трепонемы. Процент иммобилизации трепонем можно подсчитывать по формуле: (А-В): А, где А - количество подвижных трепонем в контроле, В - в опыте.

РИВ - реакция иммобилизации вибриона.

В две пробирки вносят по 0,5 мл бульонной культуры хорошо подвижных холерных вибрионов для определения их специфичности. В одну пробирку вносят 0,5 мл холерной антисыворотки, например, типа Огава в разведении 1: 5, во вторую 0,85% раствор хлорида натрия. Пастеровскими пипетками наносят на предметное стекло две капли: из опытной и контрольной пробирок, покрывают покровными стеклами и просматривают в темнопольном микроскопе.

Если вибрион по специфичности соответствует сыворотке, то активность его движения заметно падает и через несколько минут прекращается. В это время в контрольной капле движение вибриона продолжается. Если антисыворотка была гетерологичной, то на движении вибрионов это не отразится.

Метод нейтрализации

Основан на нейтрализации вируса антисывороткой, что изменяет свойства вириона, например, по отношению к эритроцитам.

РТГА - реакция торможения гемагглютинации.

Реакция может быть направлена на определение антител к вирусу в сыворотках или на обнаружение вируса в материале.

Для реакции необходимо:

1. Эритроциты кур.

2. Гемагглютинирующий вирус.

3. Антисыворотка к вирусу.

4. Раствор Альсевера - растворитель.

5. Забуференный раствор 0,85 % хлорида натрия

5. Пипетки, пластины типа Такачи, пробирки.

1. Определение антител в сыворотке.

В стерильный флакон (250 мл) вносят 50 мл раствора Альсевера. В стерильный шприц на 50 мл с иглой 7-9 см насасывают 15 мл раствора Альсевера из флакона и делают пункцию сердца взрослой курицы, набирая 15 мл крови в шприц. Иглу снимают, шприц покачивают, перемешивая жидкость. Затем кровь выливают во флакон. Эритроциты отмывают в растворе Альсевера и делают в этом же растворе 4 % взвесь.

Геммагглютинирующий вирус готовят из вирусной суспензии, получая взвесь цельного гемагглютинирующего вируса (ГВ).

Первым подготовительным этапом является определение титра ГВ, путем титрования вируса. В микротитраторах типа Такачи в двух паралллельных рядах делают разведения вируса от 1:5 до 1:2560. Для этого, капельницей вносят растворитель рН 7,2 по 0,05 мл (две капли) во все лунки, начиная со второй. В первую лунку вносят гемагглютинирующий вирус (ГВ) в разведении 1: 5 в объеме 0,1 мл. С помощью микротитровальных петель объемом на 0,05 мл или дозатора делают разведения, как обычно. Затем в каждую лунку вносят по капле 0,5 % взвеси эритроцитов курицы. Пластины легко встряхивают и оставляют на 30 мин для оседания эритроцитов.

За титр ГВ принимают последнее его разведение, где отмечена полная гемагглютинация. Для РТГА используют 4 гемагглютинирующих единицы. Для этого разведение ГВ, дающее титр реакции, следует сконцентрировать в 8 раз (разделить на 8). После этого необходимо сделать контроль правильности выбора 4 полученных единиц. Для этого делают несколько последовательных разведений, начиная с 4 ГЕ (в первой лунке), далее 2 ГЕ (вторая лунка), 1 ГЕ в третьей лунке и 0,5 ГЕ в четвертой лунке. Во все лунки вносят эритроциты. Если ГЕ выбраны правильно, то реакция вирусной гемагглютинации будет наблюдаться в первых трех лунках.

Постановка опыта. Микрокапельницей вносят со 2 по 10 лунку микропланшета по 0,025 мл растворителя (опытный ряд) и со 2 по 5 лунку второго ряда контрольного. Затем в первые лунки двух рядов добавляют по 0,05 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:5.

С помощью петель с головками на 0,025 мл или дозаторов титруют сыворотку как обычно. Затем во все лунки первого ряда вносят по 1 капле суспензии ГВ, содержащей 4 ГЕ, а в контрольный ряд - по 0,025 мл растворителя.

Пластины оставляют на 30 мин при комнатной температуре. После этого, во все лунки двух рядов закапывают по 1 капле 0,5 % взвеси эритроцитов курицы и пластины вновь оставляют на 60 мин. Начинают учет с контрольного ряда, где эритроциты оседают в виде маленького колечка или пуговочки. Если в сыворотке присутствуют антитела, гомологичные ГВ, то в первых лунках первого ряда будет нейтрализация вируса антителами.

Это должно проявиться отсутствием гемагглютинации в первых лунках. В последующих лунках первого ряда сыворотка теряет концентрацию (учитывая последовательные ее разведения) и не может нейтрализовать весь вирус, поэтому в этих лунках будет наблюдаться положительная реакция гемагглютинации - в виде зонтика. Если антител не было, то во всех лунках будет гемагглютинация.

2. Обнаружение вируса.

Вируссодержащий материал вносят в 1-е лунки двух рядов микропланшета по 0,025 мл. Во все остальные лунки этих рядов, включая и первые лунки, добавляют по 0,025 мл 0,85 % раствора хлорида натрия. Делают раститровку вируса, как описано выше. Далее во все лунки первого ряда вносят по 0,025 мл известной иммунной сыворотки против предполагаемого вируса, в разведении 1:20. Во второй ряд (контроль) вносят по 0,025 мл растворителя. Смесь оставляют на 30 мин при 37^о С, затем во все лунки двух рядов добавляют по 0,025 мл 1 % взвеси эритроцитов курицы. Учет реакции ведут через 60 мин экспозиции при 37^о С.

В контрольном ряду вирусная гемагглютинация будет наблюдаться, например, до 8-ой лунки. В опыте могут быть два варианта. Если гемагглютинирующий вирус не соответствует по специфичности сыворотке, то в этом случае титр гемагглютинации в первом ряду лунок будет соответствовать второму ряду. Если вирус гомологичен известной иммунной сыворотке, то произойдет из взаимодействие, следовательно, взаимная нейтрализация, Поскольку ГВ в этих лунках не будет, это проявится укорочением числа лунок с реакцией гемагглютинации в первом ряду, по сравнению с лунками второго ряда. Например, в 1 ряду гемагглютинация составит 5 лунок.

Реакция применяется в вирусологических исследованиях для поиска антител или вируса в соответствующем материале.

Метод гашения действия.

Метод основан на нейтрализации вируса и его болезнетворного действия.

РН - реакция нейтрализации.

Для проведения метода требуются

1. Вирус с выраженной инфекционной активностью.

2. Антисыворотка известная или исследуемая.

3. Биологический объект (лабораторное животное, культуры тканей, эмбрионы).

4. Растворители (физиологический раствор при работе с животными, среда 199, Игла, Эрла - для работы с культурой клеток).

Вируссодержащий материал (ВСМ) предварительно титруют, определяя конечное разведение, которое может вызвать повреждение тканей или инфицирование животных или эмбрионов.

Готовят 10-кратные разведения ВСМ в пробирках, используя для каждого разведения отдельную пипетку. Для этого, в пробирки вносят 1 мл растворителя и в первую пробирку 0,1 мл ВСМ. Из первой пробирки переносят во вторую 0,1 мл вируссодержащей жидкости, перемешивают, переносят 0,1 мл в третью и т.д. Каждое разведение вируса из пробирки вносят в несколько лунок, содержащих пласт клеток, по 0,2 мл. Наблюдают за культурой клеток 2-3 суток. Титр вируса выражают в 50 % дозе - ТКИД50, это гибель 50 % клеток.

Постановка опыта. В пробирках делают последовательные разведения испытуемых сывороток в объеме 0,5 мл. Во все лунки вносят по 100 ТКИД ВСМ, выдерживают смесь 1-2 ч при комнатной температуре, затем каждое разведение вносят в пласт клеток в лунках. Если вирус был нейтрализован антителами, то размножения в культуре не последует - это проявится отсутствием ЦПД (цитопатического действия). Там, где вирус оставался нативным, отмечено ЦПД.

Вариант с животными. Например, проводят выявление антител в сыворотках людей с подозрением на бешенство. К 10-кратным разведениям ВСМ в пробирках добавляют равный объем исследуемой сыворотки в разведении 1:10. Параллельно делают контрольный ряд (нормальная сыворотка). Пробирки оставляют на 1 ч при 37^о С. Смесь вводят в мозг молодым взрослым белым мышам и наблюдают 30 суток. Мыши, зараженные смесью вируса с антителами, не болевают, а зараженные смесью вируса с нормальной сывороткой погибают от энцефалита.

Цветная проба. Антисыворотки смешивают с вирусом по 0,4 мл (ТКИД50). Через 2 ч вносят 0,2 мл смеси в лунку с культурой клеток и наслаивают сверху вазелин 0,2 мл для изоляции от кислорода воздуха. На протяжении 6-8 дней регистрируют изменение цвета среды. В лунках, где был внесен нейтрализованный вирус, цвет среды изменится от красного к желтому. Там, где вирус был живым, клетки погибли, а цвет среды оставался красным.

Феномен иммуноконъюгации

Основан на конъюгации метки разной природы на одном из компонентов реакции антиген-антитело или на дополнительном агенте.

РИА - радиоиммунологический анализ.

Прямой метод.

В лунки двух рядов полистироловых планшет вносят исследуемый на антиген экстракт, в концентрации 0,05 мкг, выдерживают 12 ч при комнатной температуре, отмывают планшет физиологическим раствором, содержащим 5 % по объему фосфатного буфера и 2 % твина-20. В качестве конъюгата используют иммунный глобулин, который соответствует по специфичности предполагаемому антигену, меченный J ¹²⁵.

Вносят конъюгат во все лунки двух рядов. Выдерживают 60 мин при 37^о С, трижды отмывают растворителем и определяют дозаторами остаточную долю связавшейся метки, против той, которая была на конъюгате.

Непрямой метод.

Полистироловые планшеты, применяемые для ИФА, нагружают антигеном в рабочей дозе (предварительно выбирается доза, связывающая 50 % метки). Для этого, растворимый антиген (вируссодержащую жидкость) заливают в лунки микротитратора пипетками по 0,1 мл и оставляют на ночь при комнатной температуре. На другой день лунки с антигеном трижды отмывают растворителем для удаления свободного антигена.

В лунки с сорбированным антигеном вносят по 0,1 мл разведения испытуемой на антитела сыворотки. Разведения сыворотки предварительно готовят в пробирках и по 0,1 мл вносят в лунки планшета, начиная с последней пробирки (вносят в последнюю лунку) и т.д. Планшету оставляют на 40 мин при 37^о С, трижды отмывают растворителем для удаления свободных компонентов сыворотки.

Предварительно готовят конъюгат. Из антисыворотки кроличьей против сывороточных белков человека получают глобулин, путем высаливания 40 % сульфатом аммония. От соли глобулин очищают одним из методов, например, пропуская через сефадекс G50. Затем этот глобулин добавляют к смеси J ¹²⁵ и хлорамина Т в равных объемах, через 2 мин реакцию останавливают с помощью NaHSO₃ и проводят разделение меченого глобулина и свободных компонентов на сефадексе-G25. Меченый глобулин консервируют 0,2 % азида натрия.

Заранее приготовленный конъюгат вносят во все лунки планшет по 0,1 мл, выдерживают в течение 40 мин при 37^о С, а затем трижды отмывают лунки растворителем. Далее в лунках плпншет следует проводить определение доли связанного йода по сравнению с количеством его в конъюгате.

Торможение метода.

В лунки полистироловых планшет вносят антиген в рабочей дозе, выдерживают 12 ч при комнатной температуре, отмывают трижды растворителем.

В лунки с антигеном вносят по 0,1 мл исследуемой сыворотки, разведения которой предварительно приготовлены в пробирках (как описано выше). Планшеты выдерживают 40 мин при 37^о С, отмывают растворителем. Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл иммунного глобулина, меченого J ¹²⁵, специфичного к сорбированному антигену. Планшет выдерживают 40 мин при 37^о С, отмывают трижды растворителем. Определяют остаточную дозу метки в лунках, по сравнению с конъюгатом.

Если в исследуемой сыворотке были антитела, то они блокировали антиген в лунках и последующее внесение меченого иммунного глобулина не приводит к связыванию его с антигеном. Это проявляется отсутствием метки в лунках, где были антитела исследуемой сыворотки. Если антител нет, то внесение меченых антител приведет к связыванию их антигеном, что проявится появлением метки во всех лунках. Это отрицательный результат.

ИфА - иммуноферментный анализ

Основан на конъюгации метки в виде фермента.

Прямой метод.

Метод заключается в непосредственном взаимодействии антигена и антител, когда один из них сорбирован на твердой фазе, а другой мечен ферментом.

В настоящем разделе будет дан новый вариант ИФА, тогда как известные варианты широко описаны в литературе.

ИФАП - иммуноферментный анализ прямой.

В лунки полистироловых планшет, например, Санкт-Петербургского зав. биополимеров или другого производства, вносят растворимый на антиген материал по 0,1 мл в дозе 0,05 мкг на 1 мл и планшет оставляют на 24 ч при комнатной температуре. Планшет отмывают растворителем (0,85 % раствор хлорида натрия, содержащий 0,2 % твина-20, рН 7,2) от несвязавшегося материала.

Предварительно готовят конъюгат: к раствору глобулина иммунной сыворотки, которая должна быть гомологичной предполагаемому антигену по специфичности, в дозе 5 мг на мл, добавляют равный объем раствора каталазы в дозе 10 мг на мл и 0,1 % от объема смеси 2,5 % глутарового альдегида. Смесь выдерживают 30 мин при 37^о С, осаждают глобулин 40 % раствором сульфата аммония, растворяют малым объемом растворителя и освобождаются от солей аммония, пропуская глобулин через колонку с сефадексом G-50. Готовый конъюгат хранят с 0,05 % азида натрия или лиофилизируют.

Во все лунки с материалом вносят конъюгат по 0,1 мл и смесь оставляют на 60 мин, после чего трижды промывают растворителем.

Для проявления взаимодействия антигена с антителом необходимо выявить в лунках каталазу. Для этого, вносят субстрат - перекись водорода (0,015 % по 0,1 мл) и через 15 мин вносят хромоген, для проявления реакции каталазы с субстратом - 1 % раствор перманганата калия. Результат реакции оценивают по появлению окрашивания. Если в исследуемом материале есть антиген, то с ним взаимодействуют антитела, которые мечены ферментом. Добавленная перекись водорода разрушается каталазой на воду и атомарный кислород и вносимый хромоген проявляет эту реакцию - жидкость остается красного цвета. Если антигена не было, то антител также не будет как и каталазы. Перекись водорода остается неразрушенной и добавленный перманганат калия моментально меняет цвет на желтый, сходный с контрольной лункой.

Непрямой метод.

ИФА - иммуноферментный анализ.

Существуем много вариантов постановки ИФА, в том числе - твердофазных, на одном из них мы и остановимся.

В микропланшеты вносят по 0,1 мл раствора известного растворимого антигена в дозе 0,05 мкг на мл. Планшеты оставляют на 24 ч при комнатной температуре, трижды отмывают растворителем.

Делают несколько последовательных разведений исследуемой иммунной сыворотки в пробирках в объеме 0,5 мл, начиная с 1:50. Последней пробиркой является контрольная – без сыворотки. Начиная с контроля, вносят в последнюю лунку планшета 0,1 мл (контроль), в предпоследнюю лунку планшета - 0,1 мл разведения из предпоследней пробирки и т.д. Смесь оставляют на 30 мин при 37^о С и затем трижды промывают лунки растворителем. После этого вносят во все лунки видовой конъюгат по 0,1 мл Смесь выдерживают 40 мин при комнатной температуре и трижды промывают растворителем. А затем вносят субстрат и хромоген.

Предварительно делают конъюгат, как описано выше, только в качестве сыворотки берут кроличью антисыворотку к сывороточным белкам человека, которую метят ферментом каталазой (как описано выше). Получаем видовой конъюгат против белков сыворотки людей. Применение такого препарата более выгодно, чем на основе гомологичной иммунной сыворотки к антигену. Такую сыворотку необходимо готовить заново при новом антигене, а видовой конъюгат можно использовать во всех случаях исследования сывороток людей.

Если исследуемая сыворотка содержала антитела, то происходит взаимодействие ее с антигеном и на Fc-фрагмент ее антител прикрепляются антитела из конъюгата (кроличья антисыворотка к белкам сыворотки человека) меченого ферментом. Он разлагает внесенный в лунки субстрат и хромоген (перманганат калия) не изменит своего красного цвета. Если антител в сыворотке исследуемой нет, то не будет и фермента и субстрат будет действовать на хромоген, который мгновенно изменит цвет среды на желтый (таблица № 24).

Таблица № 24.

Схема постановки непрямого варианта ИФА

Лунки планшет	Последовательность процесса постановки непрямого варианта ИФА
	антиген	процесс отмывания		антисы- воротка	процесс отмывания	конъю- гат	субстрат	хромоген		резуль- тат ИФА
	Дополнительная характеристика вносимых агентов, в мг или мл
	в рабо-чей дозе	фосфатн. буфер + твин-20	- 1:100 или раствори-тель		то же	на 30 мин	перекись водорода на 15 мин		перманга-нат калия		окраска, момен- тально
1-я. Опыт	0,05 мл	3 раза	0,025 мл		3 раза	0,05 мл	0,05 мл		0,05 мл		красная
2-я. Контроль	0,05 мл	3 раза	растворитель по 0,025 мл		3 раза	0,05 мл	0,05 мл		0,05 мл		желтая

Торможение метода.

К этому методу относятся конкурентные пробы, названные так по сути происходящего процесса. Торможение - это конечный эффект реакций.

В лунки микропланшета двух рядов вносят иммунный глобулин известной сыворотки для адсорбции на стенках лунок пластин (24 ч при комнатной температуре, рН 6,0). После экспозиции лунки трижды отмывают растворителем. Затем в лунки двух рядов вносят по 0,1 мл осветленного копроэкстракта, исследуемого пациента. Копроэкстракт был заранее приготовлен в пробирках в 5 последовательных разведениях (как описано выше). После экспозиции 30 мин при 37^о С, пластины трижды отмывают растворителем. В первый ряд с экстрактом вносят общим объемом 0,1 мл смесь сывороток: иммунную и эту же иммунную, но меченую каталазой. Во второй ряд - только иммунную сыворотку, меченую ферментом. После экспозиции 30 мин пластину трижды отмывают растворителем.

В оба ряда вносят перекись водорода, а через 15 мин и перманганат калия. Проводят учет реакции по изменению цвета лунок в сравнении с контрольным рядом (второй).

Если в исследуемом материале есть антиген, то в первом ряду произойдет конкуренция за детерминанты между мечеными и немечеными антителами. Результатом этого будет укорочение числа лунок с положительным результатом в первом ряду по сравнению со вторым, где конкуренции не было. Если антигена не было, то положительных лунок не будет ни в первом ряду, ни во втором, т.е. цвет лунок будет желтым.

ИФА считается одним из лучших методов, применяемых в практике, с высокой чувствительностью и специфичностью.

Применяемые методы ИФА описаны в разделе для визуального учета, хотя существует автоматизация в прочтении результатов и постановке ИФА. При постановке на современной аппаратуре не виден механизм реакции, поэтому упор был сделан на постановку ИФА при визуальном прочтении результатов.

Следует учесть, что на сегодня разработаны новые методы, которые не относятся к иммунологическим, т.е. там нет взаимодействия антител с антигенами, например, зонды ДНК и др. или комбинированный молекулярно-генетический и электрофоретический метод - ПЦР.

ПЦР – полимеразная цепная реакция

Метод предложен американским исследователем Карри Мюллисом (1983), удостоенным в 1993 г Нобелевской премии. Эта реакция носит название репликации ДНК.

Открытие термостабильной Tag-полимеразы (ДНК-полимеразы) из термофильных бактерий Thermis aguaticus, оптимум которой находится в области 70-72^о С, позволило делать процесс репликации ДНК циклическим. При этом происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК.

Комплементарное достраивание цепи начинается только в стартовых блоках – коротких двунитевых участках. Присоединение таких блоков к специфическим участкам ДНК направляет процесс синтеза новой цепи только в этом участке ДНК.

Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК достаточно использовать две олигонуклеотидных затравки (20 нуклеотидных пар), называемых праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.

Метод ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий, называемых амплификации, специфического участка ДНК, катализируемое ферментом Tag-полимеразой.

Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в разных температурных режимах.

1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95^о С в течение 30-40 сек.

2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значение которой располагается в интервале 50-65^о С. Время отжига 20-60 сек.

3 этап: Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК идет от 5’ - конца к 3^’-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участка присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор gHTФ – дезоксирибонуклеотидтрифосфат. Процесс синтеза новой цепи катализируется ферментом - термостабильной Tag-полимеразой и проходит при температуре 70-72^о С. Время синтеза 20-40 сек. Образовавшиеся новые цепи служат матрицами для второго цикла амплификации, в которой происходит образование специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах ампликон служит матрицей для синтеза новых цепей. За 30-40 циклов рабочий раствор накапливает 10⁸ молекул ампликона.

. Исследуемым материалом служат соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка крови, плевральная жидкость и СПЖ, моча, мокрота, слизь и др.

Выделение ДНК из образца. Способ выделения ДНК зависит от вида возбудителя и от клинического образца. В некоторых случаях добавляют лизирующий агент, содержащий раствор гуанидина, сорбции ДНК на сорбенте, многократное отмывание и ресорбция ДНК. В других случаях необходима депротеинизация фенолом или хлороформом с последующим осаждением ДНК этанолом или изопропанолом, обработка ведется в микроцентрифужных пробирках типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл. Время обработки 1,5-2 ч.

Проведение ПЦР. Определенное количество образца из обработанной клинической пробы переносят в специальную микроцентрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 0,5 мл. В эту же пробирку добавляют амплификационную смесь, состоящую из воды, ПЦР-буфера, раствора gHTФ, раствора праймеров и раствора Tag-полимеразы (добавляют в последнюю очередь). Объем реакционной смеси составляет 2,5 мкл. В пробирку добавляют одну каплю минерального масла для предотвращения испаренения жидкости. Пробирку переносят в программируемый термостат (амплификатор) и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе, соответствующей виду определенного возбудителя. Время проведения реакции в зависимости от программы составляет 2-3 ч.

Контроль реакции осуществляется одновременной постановкой ПЦР на клиническом материале: положительный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала вносят контрольный препарат ДНК. Отрицательный контроль включает все компоненты реакции, а вместо клинического материала вносят соответствующее количество деионизированной воды.

Регистрация результатов. Амплифицированный специфический фрагмент ДНК можно выявить методом электрофореза в 1 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединенеи внедрения, проявляющееся в виде светящихся полосок при облучении геля УФ-лучами с длиной волны 290-330 нм. Для приготовления агарозного геля расплавляют в СВЧ-печи или на водяной бане смесь агарозы, буфера и воды, добавляют раствор бромистого этидия, охлаждают до 50^о С смесь тонким слоем заливают в форму и с помощью специальных гребенок делают в геле карманы для нанесения образца. После застывания геля в его карманы наносят амплификат, смешанный с буфером для нанесения образца, содержащего краситель. Гель с нанесенным образцом переносят в камеру для электрофореза, заполненную буфером. Камеру подключают к источнику питания и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30-45 мин. Гель просматривают в УФ-свете с помощью трансиллюминатора, желательно фотографируют. Результат оценивают по наличию в анализируемой пробе ДНК- фрагмента, пятно которого располагается на том же уровне, что и пятно контрольного ДНК- препарата. Такие фрагменты синтезируются при наличии в исследуемом материале клеток соответствующего возбудителя.

ИММУНОБЛОТИНГ

Метод состоит из трех этапов.Электрофоретическое фракционирование белков ВИЧ в полиакриламидном геле.

Смесь белков наносят вместе с маркерным красителем бромфеноловым голубым на поверхность полиакриламидного геля и препарат помещают в специальную камеру для вертикального электрофореза. Включают слабый постоянный ток и белки ВИЧ двигаются в геле на определенные расстояния, согласно их молекулярной массе. Чем меньше масса белка, тем дальше он продвигается в геле от катода к аноду. Зоны присутствия белка окрашиваются маркерным красителем.

1. Электрофоретический перенос вирусных белков с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ).

Окрашенные зоны белка ВИЧ в геле отмывают в буфере, содержащем твин-20, и далее помещают в аппарата для горизонтального электрофореза. Подключают слабый постоянный ток и белки начинают двигаться к аноду. В конце полиакриламидного геля устанавливают НЦМ. Белки, двигаясь в геле, переходят на НЦМ. Нитроцеллюлозную мембрану отмывают в буфере, подсушивают. Далее НЦМ разрезают на узкие полоски – стрипы, размером 0,5х10 см. На поверхности стрипов находятся белки с разной молекулярной массой.

2. Выявление антител к белкам ВИЧ.

Стрипы помещают в микрованночку, наносят на них исследуемую сыворотку пациента, инкубируют 30 мин, промывают буфером от несвязавшихся компонентов сыворотки. Затем добавляют кроличью антисыворотку к белкам сыворотки человека. меченую ферментом. Это конъюгат. Буфером отмывают стрипы от несвязавшегося конъюгата. Для визуализации реакции добавляют смесь субстрата и хромогена (Н₂О₂ и бетанитрохлорбензол).

При наличии в исследуемой сыворотке антител к структурным белкам ВИЧ происходит их адсорбция на соответствующих участках стрипа. Добавляемая антиглобулиновая сыворотка, меченая пероксидазой хрена, фиксируется на антителах исследуемой сыворотки. Пероксидаза хрена расщепляет добавленный субстрат (перекись водорода) и цвет индикатора меняется. Наличие голубых полос на стрипе свидетельствует о присутствии антител в сыворотке крови обследуемого к соответствующим белкам ВИЧ. Опытный стрип сравнивают с контрольным и анализируют: к каким белкам ВИЧ имеются антитела в исследуемой сыворотке. Делают заключение о наличие антител к вирусу.