- •Химия отрасли Часть 1
- •© Панасюк а.Л., Жирова в.В., Розправкова о.В., Лилье м.В., Богатырева е.В. Химия отрасли. Учебно-практическое пособие. – м.,мгуту, 2004
- •Часть 1. Химический состав винограда и вина
- •Глава 1. Кислоты
- •Глава 2. Углеводы
- •Глава 3. Азотистые вещества
- •Глава 4. Фенольные вещества
- •Глава 5. Ферменты
- •Глава 6. Минеральные вещества
- •Химия отрасли упп часть 1 2705
Глава 5. Ферменты
Ферменты - катализаторы биологической природы. Все ферменты являются белками. Они ускоряют скорость реакции в сотни - тысячи раз. Ферменты отличаются специфичностью, то есть каждый фермент катализирует строго определенную реакцию.
Наряду со строгой существует и групповая специфичность (например, ферменты подкласса эстераз катализируют группу реакций синтеза эфиров).
Так как ферменты - белки, то они очень чувствительны к изменению температуры. Для большинства ферментов оптимальной является температура в пределах 2537ОС. Наряду с термолабильными (или термочувствительными) существуют и термостабильные ферменты, к которым относятся многие гидролазы и пектинолитические ферменты, катализирующие процесс расщепления пектиновых веществ. Они стабильны при температуре в пределах 5080ОС. Ферменты также весьма чувствительны к изменению рН среды. В основном для ферментов оптимальным является рН=59, но существует и исключение: протеолитические ферменты, катализирующие гидролиз белков, хорошо функционируют в кислой среде рН~1,5 (например, фермент пепсин, кислые протеазы).
Механизм действия ферментов, по современным предствалениям, заключается в образовании энзим-субстратного комплекса при взаимолействии фермента с субстратом; энзим-субстратный комплекс разрушается и образуется фермент и продукт реакции:
Е + S ES E + P,
где Е - фермент, S - субстрат, ES - энзим-субстратный комплекс, Р - продукты реакции.
При образовании энзим - субстратного комплекса ослабевают силы межмолекулярного взаимодействия в субстрате, снижается энергия активации, необходимая для протекания данной реакции, и увеличивается скорость протекания данной реакции.
Считается, что каждый фермент Е должен подходить к своему субстрату S :
Е +
S
ES-комплекс Е Р
При данном взаимодействии фермента и субстрата происходит перераспределение электронной плотности, ослабевают силы межмолекулярного взаимодействия в самом субстрате. В результате образуется продукт реакции и свободный фермент.
Участок в ферменте, где присоединяется субстрат, называется активным центром фермента. В активном центре многих ферментов находятся поливалентные катионы, способные менять свою валентность - катионы Fe+2, Fe+3, Cu+, Cu+2, Mg+2 и другие.
Существуют вещества, которые повышают активность самого фермента. Данные вещества называются активаторами. К ним относится цистеин, трипептид глютатион (с последовательностью гли-ала-глю). Также имеются вещества, которые снижают активность ферментов, вызывая ингибирование. Такие вещества называются ингибиторами. Среди них такие вещества, как кислоты ( например, 3-хлоруксусная - белковый осадитель), фенольные вещества, соли циановодородной кислоты HCN, вещества, которые взаимодействуют с металлами активного центра фермента (осадители тяжелых металлов - сернистая кислота H2SO3, которая взаимодействует с солями меди и др. металлов).
Ингибиторы - довольно широкая группа веществ, вызывающих ингибирование, вплоть до инактивации фермента.
Активность ферментов в клетке регулируется связыванием их на различных структурах клетки.
Помимо активного центра в молекуле фермента присутствует аллостерический центр. К нему может присоединяться вещество, называемое эффектором. Присоединение эффектора к аллостерическому центру вызыввает изменение активности (чаще всего падение активности). Часто такими эффекторами служат промежуточные и конечные продукты реакции.
Эффектор
Аллостерическое ингибирование встречается при спиртовом брожении, характерно для реакций образования побочных продуктов брожения [см. II часть “Химии вина”].
Следует отметить, что многие ферменты разделяются на фракции - изоферменты. Большинство ферментов носят название субстрата.
При созревании винограда в живой клетке действие ферментов локализовано. При этом существует определенная координация действия ферментов. При разрушении клетки винограда изменяется энтропия системы, поступает кислород воздуха и т.д., то есть происходят нерегулируемые биохимические превращения в клетке.
5.1. Классы ферментов
1. ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ
катализируют окислительно-восстановительные реакции;
2. ТРАНСФЕРАЗЫ
катализируют реакции переноса;
3. ГИДРОЛАЗЫ
катализируют реакции гидролиза с участием воды;
4. ЛИАЗЫ
катализируют реакции негидролитического расщепления;
5. ИЗОМЕРАЗЫ
катализируют реакции изомеризации
6. СИНТЕТАЗЫ (ЛИГАЗЫ)
катализируют процессы синтеза с образованием или распадом соединений с макроэргической связью.
Наиболее изученными для винограда и вина являются ферменты классов оксидоредуктаз и гидролаз.
5.1.1. Оксидоредуктазы
Среди этого класса ферментов в винограде и вине обнаружены дегидрогеназы (ДГ) и оксидазы.
Дегидрогеназы
АлкогольДГ
-2Н
С 2Н5ОН СН3СН=О
этанол NАД уксусный альдегид
Этот фермент очень активен в дрожжах, обнаружено несколько изоферментов. АлкогольДГ катализирует также реакции окисления изобутилового и изоамилового спиртов с образованием изомасляного и изовалерианового альдегидов.
Восстановительная функция (восстановление альдегида в спирт) этого фермента имеет значение при алкогольном брожении. Окислительная функция (окисление спирта в альдегид) является важнейшей реакцией процесса получения Хереса (Херес имеет солоноватый вкус и яркий аромат) - технологический прием хересование (алкогольДГ хересных дрожжей при аэробном доступе кислорода осуществляет реакцию окисления).
МалатДГ
Катализирует следующую реакцию:
C OOH COOH
C HOH - 2 Н C=O
C H2 NАД CH2
COOH COOH
Яблочная кислота Щавелевоуксусная кислота
Данная реакция имеет значение при ЯМБ, при выдержке вина на дрожжах, при хересовании, при раздавливании винограда, т.е. там, где вино контактирует с дрожжевыми клетками.
СукцинатДГ
COOH COOH
CH2 - 2 Н CН
CH2 ФАД CH
COOH COOH
Янтарная кислота Фумаровая кислота
Акцептором ионов водорода является ФАД.
Данная реакция протекает при дыхании по циклу Кребса, при раздавливании винограда. Фермент активен в дрожжах, виноградном соке и вине.
АланинДГ
COOH COOH
-NH3
C HNH2 - 2 Н C=O
CH3 CH3
Аланин Пировиноградная кислота
АланинДГ катализирует реакцию отщепления двух атомов водорода и молекулы аммиака с образованием пировиноградной кислоты. Фермент активен в дрожжах, винограде, соке и вине. Имеет значение при росте виноградной ягода, размножении дрожжей. Участвует в ферментативных реакциях после разрушения виноградной ягоды.
ГлютаматДГ
COOH COOH
( CH2)2 -NH3 (CH2)2
CHNH2 -2Н C=О
COOH COOH
Глютаминовая -кетоглютаровая
кислота кислота
Катализирует реакцию отщепления двух атомов водорода и молекулы аммиака с образованием -кетоглютаровой кислоты. Фермент активен в дрожжах, винограде, соке и вине. Имеет значение при росте виноградной ягода, размножении дрожжей. Участвует в ферментных реакциях после разрушения виноградной ягоды.
Все вышерассмотренные ДГ, за исключением алкогольДГ, впервые были обнаружены сотрудниками кафедры (доц. Белоусовой И.Д.).
ДГ имеют значение (особенно их восстановительная функция) в процессе производства шампанского при выдержке вина на дрожжах (процесс шампанизации), когда ускоряются восстановительные реакции.
Оксидазы
О-дифенолоксидаза (полифенолоксидаза - ПФО)
ПФО очень активна в винограде, яблоках и других фруктах. В результате катализа этой реакции происходит потемнение (покоричневение) соков, т.к. образуются хиноны (неустойчивые вещества), которые полимеризуются с образованием темноокрашенных (коричневых) полимеров.
ОН
НО 8 О 1 В ОН -2Н
7 2
А С
6 3
5 4
ОН
О
НО 8 О 1 В О
7 2
А С
6 3
5 4
ОН
Хинон
Полимеризация
Х инон Темноокрашенные полимеры
Изучению ПФО посвящены работы Родопуло.
Вешерассмотренная реакция имеет большое практическое значение.
П ФО - купропротеид (медьсодержащий белок). В активном центре этого фермента находятся ионы меди Сu+. Переход Cu+ Cu+2 способствует переходу электронов и ускоряет окислительно-восстановительную реакцию.
Ингибиторами ПФО являются вещества, которые действуют на соли меди.
Наиболее простой способ инактивировать этот фермент - добавление белкового осадителя (бентонитовой глины), который осаждает все белки, в том числе и ПФО, предотвращая ее дальнейшее действие. Также в виноделии используется SO2 (см. тему “Кислоты”).
Можно привести следующий график, который показывает зависимость активности ПФО от концентрации сернистого ангидрида (с увеличением кинцентрации сернистого ангидрида, активность ПФО падает).
Е Е - активность фермента ПФО
100%
100 120 СSO2, мг/л
По данным П.Риберо-Гайона, концентрация SO2 С=100-120 мг/л вызывает полную инактивацию ПФО.
Е Е - активность фермента ПФО
100%
, сутки
Оказалось, что в процессе брожения активность ПФО падает. Существует следующее мнение: это связано с тем, что в процессе брожения дрожжи выделяют сульфгидрильные соединения, содержащие SH-группу. Данные группы блокируют активный центр фермента и вызывают его инактивацию.
Однако, точка зрения сотрудников кафедры совсем иная: в процессе брожения в присутствии кислорода при активном размножении дрожжей происходит процесс адсорбции ферментов на поверхности дрожжевой клетки (концентрация дрожжей очень высокая - 108клеток/1 мл среды), в результате чего активность ферментов падает.
Дрожжевые клетки имеют протеолитические ферменты, которые используются для гидролиза белков, в результате чего получаются АМК, используемые в дальнейшем в процессе синтеза других органических веществ.
Вина, в которых имеется активный фермент ПФО, склонны к образованию ОКСИДАЗНОГО КАССА - потемнение вина при доступе кислорода воздуха.
Особенно подвержены оксидазному кассу многие крепленые вина, т.к. при их производстве ограничен доступ кислорода и процесс брожения.
В последние годы во Франции уделяют большое внимание ПФО, который содержится в плесневых грибах - ЛАККАЗА, наряду с ПФО винограда и вина.
Лакказа очень многофункциональный фермент: окисляет АМК (тирозин) и другие вещества, в результате чего сок и вино портятся.
ПФО - самый сложный, активный и опасный фермент из всего класса оксидаз.
Менее активным оксидазам придается меньшее значение.
Пероксидаза
Катализирует окисление различных органических соединений с участием перекиси водорода Н2О2:
RH2 + H2O2 R + 2H2O, где RH2 -восстановленная форма, R - окисленная форма.
Может окислять полифенолы, АМК, органические кислоты и другие соединения.
В отличие от ПФО, пероксидаза - железосодержащий фермент (в активном центре находятся атомы железа).
Вещества, связываемые с металлами, выступают ингибиторами этого фермента.
Пероскидаза, также как и ПФО, при брожении инактивируется, и в столовом вине активность данного фермента не обнаруживается.
Аскорбатоксидаза
О=С
О=С
НО-С
С=О
О -2Н О
НО-С
С=О
НС
Н-С
СНОН
СНОН
СН2ОН
СН2ОН
Аскорбиновая Дегидроаскорбиновая
кислота кислота
Эта реакция имеет место при переработке винограда (его раздавливании), и отстое сусла. Реакция ускоряется при повышении температуры, и имеет значение в соковом поизводстве, т.к. контролируется содержание витамина С (его разрушение нежелательный процесс).
5.1.2. Гидролазы
Среди гидролаз для виноделия имеют значение несколько подклассов.
1.Эстеразы - катализируют гидролиз эфиров карбоновых кислот:
R1-C=O + HO-R2 R1-C=O
-H2O
OH O-R2
Реакция этерификации.
Различают гидролизующую и синтезирующую функции эстераз.
Эстеразы активны в дрожжевых клетках, поэтому переходят в вино при выдержке его на дрожжах. Весьма активны эстеразы в грибах Bоtrytis Cinerea.
Данные реакции гидролиза/синтеза эфира имеют значение в технологии Хереса, белых столовых вин, шампанских вин (при выдержке вина на дрожжах), сотернских вин (виноград поражен грибком Bоtrytis Cinerea).
2. Пектинолитические ферменты
В результате такого действия пектинолитических ферментов образуется метиловый спирт, полигалактуроновая, галактуроновая кислоты, а протопектин распадается на пектин.
Данная группа ферментов плохо изучена. Пектинолитические ферменты содержатся в винограде, яблоках. Но особенно много в плесневых грибах рода Aspergillus, из которых получают пектинолитичесике ферментные препараты.
С=О С=О
ОСН3 ОН
О О
О
Пектин
Стрелками показано действие на связи пектинолитических ферментов (гидролиз связей).
Гидролиз пектина имеет большое значение при переработке яблок и других фруктов. Это позволяет повысить выход сока и его осветление.
Однако, без добавления ферментных препаратов путем повышеня температуры можно добиться таких же результатов, что и при использовании ферментных препаратов. Данный способ называется тепловой мацерацией.
3. Сахаролитичесике ферменты
Среди данного подкласса особенно большее значение имеют гликозидазы.
Данный фермент катализирует гидролиз гликозидов, в результате которого образуется углевод и антоциан:
НО О + В
А С + Н2О
О У
ОН
НО О + В + У
А С
ОН
ОН
Данная реакция имеет значение при переработке красных сортов винограда.
Гликозидаза
Гликозиды терпенов + Н2О У + терпены
Терпены - пахучие вещества, которые обуславливают сортовой аромат винограда.
Эта реакция имеет очень важное значение при получении мускатных вин. Применяемые технологические приемы обеспечивают протекание данной реакции.
-фруктофуранозидаза (инвертаза, сахараза)
Данный фермент катализирует реакцию гидролиза сахарозы:
Сахараза
С ахароза + Н2О Глюкоза + Фруктоза
Его активность высока в винограде, дрожжевых клетках и вине. В технологии шампанских вин при приготовлении ликеров (экспедиционного, резервуарного) добавляют свекловичную сахарозу (концентрация сахара достигает ~60%). Благодаря ферменту сахаразе, гидролиз сахарозы заканчивается до того, как ликер направляют на шампанизацию. Данный фермент также используется в плодово-ягодном виноделии.
Работы академика Опарина показали, что этот фермент обладает также трансферазной функцией, т.е. катализирует перенос остатка этилового спирта на молекулу -фруктофуранозы:
СН2ОН СН2ОН
С 2Н5-ОН + НО-С С2Н5-О-С
-этилфруктозид
О О
СНОН СНОН
НС НС
СН2ОН СН2ОН
Учитывая, что в вине содержание этилового спирта велико, возникло предположение, что в вине может происходить данная реакция. Работы кафедры показали, что эта реакция имеет место в процессе шампанизации.
4. Протеинолитические (протеолитические) ферменты
Протеолитические ферменты катализируют гидролиз белков до пептидов (ферменты протеиназы) и пептидов до АМК (ферменты пептидазы).
Протеиназы Пептидазы
Б елки + Н2О Пептиды + Н2О АМК
Гидролиз белков до пептидов катализируют ферменты протеиназы, а гидролиз пептидов до АМК - ферменты пептидазы.
По данным кафедры, активны оба фермента, причем первые преобладают над вторыми.
Вопросы для самоконтроля по теме:
1. Чем являются ферменты?
2. Классы ферментов.
3. Какие функции присущи ферменту Алкоголь ДГ?
4. Какие реакции катализируют оксидоредуктазы?
5. Какие вина склонны к образованию оксидазного касса?
6. Какие подклассы гидролаз имеют значение в виноделии?
7. Технологическое значение ферментов.
Тесты по теме:
1.Инверсия сахарозы может происходить под действием:
А) Высших спиртов; Б) Неорганических кислот; В) Полифенолоксидазы; Г) В-Фруктофуранозидазы.
2. Под действием какого фермента происходит покоричневение соков?
А) Алкоголь ДГ; Б) Малат ДГ; В) Полифенолоксидазы; Г) Изомеразы.
3. Окислительная функция какого фермента является важнейшей реакцией получения Хереса?
А) Глютамат ДГ; Б) Аланин ДГ; В) Малат ДГ; Г) Алкоголь ДГ.
4. Какие ферменты катализируют гидролиз эфиров карбоновых кислот?
А) Эстеразы; Б) Пектинолитические ферменты; В) Пероксидаза; Г) Аскорбатоксидаза.
5. Гидролиз белков до пептидов происходит под действием фермента:
А) Гликозидазы; Б) Протеолитических ферментов; В) Трансферазы; Г) Оксидоредуктазы.