Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
3.1 Учебно-практическое пособие Х.О.вино ч1.doc
Скачиваний:
53
Добавлен:
21.09.2019
Размер:
899.07 Кб
Скачать

Глава 5. Ферменты

Ферменты - катализаторы биологической природы. Все ферменты являются белками. Они ускоряют скорость реакции в сотни - тысячи раз. Ферменты отличаются специфичностью, то есть каждый фермент катализирует строго определенную реакцию.

Наряду со строгой существует и групповая специфичность (например, ферменты подкласса эстераз катализируют группу реакций синтеза эфиров).

Так как ферменты - белки, то они очень чувствительны к изменению температуры. Для большинства ферментов оптимальной является температура в пределах 2537ОС. Наряду с термолабильными (или термочувствительными) существуют и термостабильные ферменты, к которым относятся многие гидролазы и пектинолитические ферменты, катализирующие процесс расщепления пектиновых веществ. Они стабильны при температуре в пределах 5080ОС. Ферменты также весьма чувствительны к изменению рН среды. В основном для ферментов оптимальным является рН=59, но существует и исключение: протеолитические ферменты, катализирующие гидролиз белков, хорошо функционируют в кислой среде рН~1,5 (например, фермент пепсин, кислые протеазы).

Механизм действия ферментов, по современным предствалениям, заключается в образовании энзим-субстратного комплекса при взаимолействии фермента с субстратом; энзим-субстратный комплекс разрушается и образуется фермент и продукт реакции:

Е + S  ES  E + P,

где Е - фермент, S - субстрат, ES - энзим-субстратный комплекс, Р - продукты реакции.

При образовании энзим - субстратного комплекса ослабевают силы межмолекулярного взаимодействия в субстрате, снижается энергия активации, необходимая для протекания данной реакции, и увеличивается скорость протекания данной реакции.

Считается, что каждый фермент Е должен подходить к своему субстрату S :

Е +

S

ES-комплекс Е Р

При данном взаимодействии фермента и субстрата происходит перераспределение электронной плотности, ослабевают силы межмолекулярного взаимодействия в самом субстрате. В результате образуется продукт реакции и свободный фермент.

Участок в ферменте, где присоединяется субстрат, называется активным центром фермента. В активном центре многих ферментов находятся поливалентные катионы, способные менять свою валентность - катионы Fe+2, Fe+3, Cu+, Cu+2, Mg+2 и другие.

Существуют вещества, которые повышают активность самого фермента. Данные вещества называются активаторами. К ним относится цистеин, трипептид глютатион (с последовательностью гли-ала-глю). Также имеются вещества, которые снижают активность ферментов, вызывая ингибирование. Такие вещества называются ингибиторами. Среди них такие вещества, как кислоты ( например, 3-хлоруксусная - белковый осадитель), фенольные вещества, соли циановодородной кислоты HCN, вещества, которые взаимодействуют с металлами активного центра фермента (осадители тяжелых металлов - сернистая кислота H2SO3, которая взаимодействует с солями меди и др. металлов).

Ингибиторы - довольно широкая группа веществ, вызывающих ингибирование, вплоть до инактивации фермента.

Активность ферментов в клетке регулируется связыванием их на различных структурах клетки.

Помимо активного центра в молекуле фермента присутствует аллостерический центр. К нему может присоединяться вещество, называемое эффектором. Присоединение эффектора к аллостерическому центру вызыввает изменение активности (чаще всего падение активности). Часто такими эффекторами служат промежуточные и конечные продукты реакции.

Эффектор

Аллостерическое ингибирование встречается при спиртовом брожении, характерно для реакций образования побочных продуктов брожения [см. II часть “Химии вина”].

Следует отметить, что многие ферменты разделяются на фракции - изоферменты. Большинство ферментов носят название субстрата.

При созревании винограда в живой клетке действие ферментов локализовано. При этом существует определенная координация действия ферментов. При разрушении клетки винограда изменяется энтропия системы, поступает кислород воздуха и т.д., то есть происходят нерегулируемые биохимические превращения в клетке.

5.1. Классы ферментов

1. ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ

катализируют окислительно-восстановительные реакции;

2. ТРАНСФЕРАЗЫ

катализируют реакции переноса;

3. ГИДРОЛАЗЫ

катализируют реакции гидролиза с участием воды;

4. ЛИАЗЫ

катализируют реакции негидролитического расщепления;

5. ИЗОМЕРАЗЫ

катализируют реакции изомеризации

6. СИНТЕТАЗЫ (ЛИГАЗЫ)

катализируют процессы синтеза с образованием или распадом соединений с макроэргической связью.

Наиболее изученными для винограда и вина являются ферменты классов оксидоредуктаз и гидролаз.

5.1.1. Оксидоредуктазы

Среди этого класса ферментов в винограде и вине обнаружены дегидрогеназы (ДГ) и оксидазы.

Дегидрогеназы

АлкогольДГ

-2Н

С 2Н5ОН СН3СН=О

этанол NАД уксусный альдегид

Этот фермент очень активен в дрожжах, обнаружено несколько изоферментов. АлкогольДГ катализирует также реакции окисления изобутилового и изоамилового спиртов с образованием изомасляного и изовалерианового альдегидов.

Восстановительная функция (восстановление альдегида в спирт) этого фермента имеет значение при алкогольном брожении. Окислительная функция (окисление спирта в альдегид) является важнейшей реакцией процесса получения Хереса (Херес имеет солоноватый вкус и яркий аромат) - технологический прием хересование (алкогольДГ хересных дрожжей при аэробном доступе кислорода осуществляет реакцию окисления).

МалатДГ

Катализирует следующую реакцию:

C OOH COOH

C HOH - 2 Н C=O

C H2 NАД CH2

COOH COOH

Яблочная кислота Щавелевоуксусная кислота

Данная реакция имеет значение при ЯМБ, при выдержке вина на дрожжах, при хересовании, при раздавливании винограда, т.е. там, где вино контактирует с дрожжевыми клетками.

СукцинатДГ

COOH COOH

CH2 - 2 Н CН

CH2 ФАД CH

COOH COOH

Янтарная кислота Фумаровая кислота

Акцептором ионов водорода является ФАД.

Данная реакция протекает при дыхании по циклу Кребса, при раздавливании винограда. Фермент активен в дрожжах, виноградном соке и вине.

АланинДГ

COOH COOH

-NH3

C HNH2 - 2 Н C=O

CH3 CH3

Аланин Пировиноградная кислота

АланинДГ катализирует реакцию отщепления двух атомов водорода и молекулы аммиака с образованием пировиноградной кислоты. Фермент активен в дрожжах, винограде, соке и вине. Имеет значение при росте виноградной ягода, размножении дрожжей. Участвует в ферментативных реакциях после разрушения виноградной ягоды.

ГлютаматДГ

COOH COOH

( CH2)­2­ -NH3 (CH2)2

CHNH2 -2Н C=О

COOH COOH

Глютаминовая -кетоглютаровая

кислота кислота

Катализирует реакцию отщепления двух атомов водорода и молекулы аммиака с образованием -кетоглютаровой кислоты. Фермент активен в дрожжах, винограде, соке и вине. Имеет значение при росте виноградной ягода, размножении дрожжей. Участвует в ферментных реакциях после разрушения виноградной ягоды.

Все вышерассмотренные ДГ, за исключением алкогольДГ, впервые были обнаружены сотрудниками кафедры (доц. Белоусовой И.Д.).

ДГ имеют значение (особенно их восстановительная функция) в процессе производства шампанского при выдержке вина на дрожжах (процесс шампанизации), когда ускоряются восстановительные реакции.

Оксидазы

О-дифенолоксидаза (полифенолоксидаза - ПФО)

ПФО очень активна в винограде, яблоках и других фруктах. В результате катализа этой реакции происходит потемнение (покоричневение) соков, т.к. образуются хиноны (неустойчивые вещества), которые полимеризуются с образованием темноокрашенных (коричневых) полимеров.

ОН

НО 8 О 1 В ОН -2Н

7 2

А С

6 3

5 4

ОН

О

НО 8 О 1 В О

7 2

А С

6 3

5 4

ОН

Хинон

Полимеризация

Х инон Темноокрашенные полимеры

Изучению ПФО посвящены работы Родопуло.

Вешерассмотренная реакция имеет большое практическое значение.

П ФО - купропротеид (медьсодержащий белок). В активном центре этого фермента находятся ионы меди Сu+. Переход Cu+ Cu+2 способствует переходу электронов и ускоряет окислительно-восстановительную реакцию.

Ингибиторами ПФО являются вещества, которые действуют на соли меди.

Наиболее простой способ инактивировать этот фермент - добавление белкового осадителя (бентонитовой глины), который осаждает все белки, в том числе и ПФО, предотвращая ее дальнейшее действие. Также в виноделии используется SO2 (см. тему “Кислоты”).

Можно привести следующий график, который показывает зависимость активности ПФО от концентрации сернистого ангидрида (с увеличением кинцентрации сернистого ангидрида, активность ПФО падает).

Е Е - активность фермента ПФО

100%

100 120 СSO2, мг/л

По данным П.Риберо-Гайона, концентрация SO2 С=100-120 мг/л вызывает полную инактивацию ПФО.

Е Е - активность фермента ПФО

100%

 , сутки

Оказалось, что в процессе брожения активность ПФО падает. Существует следующее мнение: это связано с тем, что в процессе брожения дрожжи выделяют сульфгидрильные соединения, содержащие SH-группу. Данные группы блокируют активный центр фермента и вызывают его инактивацию.

Однако, точка зрения сотрудников кафедры совсем иная: в процессе брожения в присутствии кислорода при активном размножении дрожжей происходит процесс адсорбции ферментов на поверхности дрожжевой клетки (концентрация дрожжей очень высокая - 108клеток/1 мл среды), в результате чего активность ферментов падает.

Дрожжевые клетки имеют протеолитические ферменты, которые используются для гидролиза белков, в результате чего получаются АМК, используемые в дальнейшем в процессе синтеза других органических веществ.

Вина, в которых имеется активный фермент ПФО, склонны к образованию ОКСИДАЗНОГО КАССА - потемнение вина при доступе кислорода воздуха.

Особенно подвержены оксидазному кассу многие крепленые вина, т.к. при их производстве ограничен доступ кислорода и процесс брожения.

В последние годы во Франции уделяют большое внимание ПФО, который содержится в плесневых грибах - ЛАККАЗА, наряду с ПФО винограда и вина.

Лакказа очень многофункциональный фермент: окисляет АМК (тирозин) и другие вещества, в результате чего сок и вино портятся.

ПФО - самый сложный, активный и опасный фермент из всего класса оксидаз.

Менее активным оксидазам придается меньшее значение.

Пероксидаза

Катализирует окисление различных органических соединений с участием перекиси водорода Н2О2:

RH2 + H2O2 R + 2H2O, где RH2 -восстановленная форма, R - окисленная форма.

Может окислять полифенолы, АМК, органические кислоты и другие соединения.

В отличие от ПФО, пероксидаза - железосодержащий фермент (в активном центре находятся атомы железа).

Вещества, связываемые с металлами, выступают ингибиторами этого фермента.

Пероскидаза, также как и ПФО, при брожении инактивируется, и в столовом вине активность данного фермента не обнаруживается.

Аскорбатоксидаза

О=С О=С

НО-С С=О

О -2Н О

НО-С С=О

НС Н-С

СНОН СНОН

СН2ОН СН2ОН

Аскорбиновая Дегидроаскорбиновая

кислота кислота

Эта реакция имеет место при переработке винограда (его раздавливании), и отстое сусла. Реакция ускоряется при повышении температуры, и имеет значение в соковом поизводстве, т.к. контролируется содержание витамина С (его разрушение нежелательный процесс).

5.1.2. Гидролазы

Среди гидролаз для виноделия имеют значение несколько подклассов.

1.Эстеразы - катализируют гидролиз эфиров карбоновых кислот:

R1-C=O + HO-R2 R1-C=O

-H2O

OH O-R2

Реакция этерификации.

Различают гидролизующую и синтезирующую функции эстераз.

Эстеразы активны в дрожжевых клетках, поэтому переходят в вино при выдержке его на дрожжах. Весьма активны эстеразы в грибах Bоtrytis Cinerea.

Данные реакции гидролиза/синтеза эфира имеют значение в технологии Хереса, белых столовых вин, шампанских вин (при выдержке вина на дрожжах), сотернских вин (виноград поражен грибком Bоtrytis Cinerea).

2. Пектинолитические ферменты

В результате такого действия пектинолитических ферментов образуется метиловый спирт, полигалактуроновая, галактуроновая кислоты, а протопектин распадается на пектин.

Данная группа ферментов плохо изучена. Пектинолитические ферменты содержатся в винограде, яблоках. Но особенно много в плесневых грибах рода Aspergillus, из которых получают пектинолитичесике ферментные препараты.

С=О С=О

ОСН3 ОН

О О

О

Пектин

Стрелками показано действие на связи пектинолитических ферментов (гидролиз связей).

Гидролиз пектина имеет большое значение при переработке яблок и других фруктов. Это позволяет повысить выход сока и его осветление.

Однако, без добавления ферментных препаратов путем повышеня температуры можно добиться таких же результатов, что и при использовании ферментных препаратов. Данный способ называется тепловой мацерацией.

3. Сахаролитичесике ферменты

Среди данного подкласса особенно большее значение имеют гликозидазы.

Данный фермент катализирует гидролиз гликозидов, в результате которого образуется углевод и антоциан:

НО О + В

А С + Н2О

О У

ОН

НО О + В + У

А С

ОН

ОН

Данная реакция имеет значение при переработке красных сортов винограда.

Гликозидаза

Гликозиды терпенов + Н2О У + терпены

Терпены - пахучие вещества, которые обуславливают сортовой аромат винограда.

Эта реакция имеет очень важное значение при получении мускатных вин. Применяемые технологические приемы обеспечивают протекание данной реакции.

-фруктофуранозидаза (инвертаза, сахараза)

Данный фермент катализирует реакцию гидролиза сахарозы:

Сахараза

С ахароза + Н2О Глюкоза + Фруктоза

Его активность высока в винограде, дрожжевых клетках и вине. В технологии шампанских вин при приготовлении ликеров (экспедиционного, резервуарного) добавляют свекловичную сахарозу (концентрация сахара достигает ~60%). Благодаря ферменту сахаразе, гидролиз сахарозы заканчивается до того, как ликер направляют на шампанизацию. Данный фермент также используется в плодово-ягодном виноделии.

Работы академика Опарина показали, что этот фермент обладает также трансферазной функцией, т.е. катализирует перенос остатка этилового спирта на молекулу -фруктофуранозы:

СН2ОН СН2ОН

С 2Н5-ОН + НО-С С2Н5-О-С

-этилфруктозид

СНОН -Н
2О СНОН

О О

СНОН СНОН

НС НС

СН2ОН СН2ОН

Учитывая, что в вине содержание этилового спирта велико, возникло предположение, что в вине может происходить данная реакция. Работы кафедры показали, что эта реакция имеет место в процессе шампанизации.

4. Протеинолитические (протеолитические) ферменты

Протеолитические ферменты катализируют гидролиз белков до пептидов (ферменты протеиназы) и пептидов до АМК (ферменты пептидазы).

Протеиназы Пептидазы

Б елки + Н2О Пептиды + Н2О АМК

Гидролиз белков до пептидов катализируют ферменты протеиназы, а гидролиз пептидов до АМК - ферменты пептидазы.

По данным кафедры, активны оба фермента, причем первые преобладают над вторыми.

Вопросы для самоконтроля по теме:

1. Чем являются ферменты?

2. Классы ферментов.

3. Какие функции присущи ферменту Алкоголь ДГ?

4. Какие реакции катализируют оксидоредуктазы?

5. Какие вина склонны к образованию оксидазного касса?

6. Какие подклассы гидролаз имеют значение в виноделии?

7. Технологическое значение ферментов.

Тесты по теме:

1.Инверсия сахарозы может происходить под действием:

А) Высших спиртов; Б) Неорганических кислот; В) Полифенолоксидазы; Г) В-Фруктофуранозидазы.

2. Под действием какого фермента происходит покоричневение соков?

А) Алкоголь ДГ; Б) Малат ДГ; В) Полифенолоксидазы; Г) Изомеразы.

3. Окислительная функция какого фермента является важнейшей реакцией получения Хереса?

А) Глютамат ДГ; Б) Аланин ДГ; В) Малат ДГ; Г) Алкоголь ДГ.

4. Какие ферменты катализируют гидролиз эфиров карбоновых кислот?

А) Эстеразы; Б) Пектинолитические ферменты; В) Пероксидаза; Г) Аскорбатоксидаза.

5. Гидролиз белков до пептидов происходит под действием фермента:

А) Гликозидазы; Б) Протеолитических ферментов; В) Трансферазы; Г) Оксидоредуктазы.