1.4.1.Посттранскрипционный процессинг

Образующийся первичный транскрипт в большинстве случаев не является готовой к выполнению своих функций молекулой РНК. Он подвергается дополнительной серии превращений, объединяемых термином процессинг. Эти превращения включают выщепление из транскрипта отдельных частей, химическую модификацию некоторых нуклеотидных остатков, присоединение, уже без участия ДНК, дополнительных нуклеотидных остатков.

Особо следует отметить наличие в первичных транскриптах эукариот больших вставок от нескольких десятков до нескольких тысяч нуклеотидов (интронов, см. Рис. 6 .8), подлежащих выщеплению в процессе созревания РНК.

Выщепление интронов называют сплайсингом. Он проходит либо или при участии специальных ферментов, либо «самопроизвольно» вследствие наличия в составе интронов особых последовательностей, катализирующих расщепление цепи РНК в определенных точках. Здесь проявляется способность самих молекул РНК выступать в качестве катализаторов расщепления рибонуклетидных цепей. Такие построенные из РНК ферменты получили название рибозимов.

Рис. 6.8. Ген цитохрома b. В гене присутствуют 4 интрона (некодирующие последовательности) и 5 экзонов (собственно кодирующие последовательности).

1.4.2.Рибозимы

Впервые процесс «самосплайсинга» был изучен на примере предшественника рРНК малой рибосомной субъединицы у одноклеточного эукариота Tetrahymena thermophila (схема процесса приведена на Рис. 6 .9).

Рис. 6.9. Механизм «самосплайсинга» рРНК у Tetrahymena thermophila.

Второй тип вырезания интронов был обнаружен при сплайсинге митохондриальных пре-мРНК (Рис. 6 .10).

Рис. 6.10. Схема сплайсинга митохондриальных пре-мРНК.

В качестве ко-субстрата используется гуанозин. На первой стадии он присоединяется фосфодиэфирной связью к 5-фосфату первого нуклеотидного остатка интрона. Одновременно происходит разрыв фосфодиэфирной связи между этим фосфатом и 3-концом левого экзона. На второй стадии 3-концевой гидроксил левого экзона атакует фосфат, стоящий на границе между интроном и правым экзоном.

В этом случае сплайсинг начинается с внутримолекулярной атаки 2-ОН-группы одного из внутренних аденозинов интрона на фосфатную группу на границе между интроном и 3-концом экзона. При этом на 5-конце интрона образуется ковалентно замкнутая петля. После этого происходит соединение экзонов и выщепление интрона в виде структуры типа «лассо».

Наконец, третий механизм сплайсинга РНК был обнаружен вироидов и вирусоидов. И те, и другие являются инфекционными молекулами РНК, поражающими некоторые растения. Они состоят примерно из 300 нуклеотидных единиц. Все они в области расщепления обладают специфической вторичной структурой, которую назвали «головкой молотка» (Рис. 6 .11). Исследования показали, что эта структура может быть разделена на субстратную часть, подвергающуюся расщеплению и собственно рибозим. Если синтезировать эти два фрагмента в виде отдельных рибоолигонуклеотидов и смешать их вместе, то происходит такой же гидролитический процесс, как и в полной структуре. Однако в этом случае рибозим может последовательно расщеплять большое число молекул субстрата. Кинетика процесса описывается классическим уравнением Михаэлиса-Ментон с константой Михаэлиса K_m = 1.3 мкМ и каталитической константой 0.5 мин^–1.

Рис. 6.11. Структура типа «головки молотка» (hammerhead). Цветом выделена субстратная часть (черным — экзон, серым — интрон). Рибозим оставлен не закрашенным.

Открытие рибозимов существенно расширило наши представления о природе и механизмах ферментативных реакций. В какой-то мере влияние этого открытия на биохимию можно сравнить с влиянием открытия обратной транскрипции.