1.4.1.Модель Михаэлиса-Ментон

В настоящее время считается твердо установленным, что химическому превращению субстрата предшествует обратимое образование не ковалентного фермент-субстратного комплекса: Простейшую односубстратную реакцию можно описать следующим химическим уравнением:

Здесь S — субстрат, E — фермент, ES — фермент-субстратный комплекс и P — продует.

Если исходная концентрация субстрата намного больше концентрации фермента, то некоторое время (пока концентрация субстрата не снизится за счет его превращения в продукт реакции) все активные места фермента будут насыщены субстратом и концентрация фермент-субстратного комплекса будет меняться очень мало. В течение этого времени [ES]  Const и

( 5.0)

Использование этого выражения затрудняет последний член, отражающий обратимость второй стадии процесса. Однако от него легко избавиться, если измерять начальные скорости ферментативной реакции v_o (тангенс угла наклона касательной к кинетической кривой, проходящей через начало координат). В этом случае [P] = 0 и вне зависимости от того, является вторая стадия обратимой или необратимой

( 5.0)

В соответствии с законом сохранения вещества [E] = [E]_o – [ES]. Поскольку [S]_o >> [E]_o, то в первые моменты протекания реакции можно пренебречь изменением концентрации субстрата по сравнению с его начальной концентрацией и с хорошей степенью точности считать, что [S]  [S]_o. Тогда

( 5.0)

и начальная скорость ферментативной реакции

( 5.0)

Рис. 5.27. Зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. Кружки — экспериментальные данные, сплошная линия результат нелинейной регрессии по уравнению Михаэлиса-Ментон [Уравнение ( 5 .0)].

Поделив числитель и знаменатель на k₁·[S]_o, получим уравнение Михаэлиса-Ментон:

( 5.0)

Это уравнение содержит только микроскопические константы и экспериментально известные величины и, таким образом, может быть использовано для анализа экспериментальных данных. Обычно его записыват в ином виде. Если все активные центры заняты субстратом, т.е. [ES] = [E]_o (принято говорить, фермент «насыщен» субстратом), то скорость ферментативного превращения максимальна (V_маrc). Множитель в знаменателе называют константой Михаэлиса и обозначают как K_m.

( 5.0)

Тогда

( 5.0)

Изучение кинетики фермента начинают с экспериментального определения начальных скоростей реакции при одной и той же концентрации фермента и различных концентрациях субстрата (см. Рис. 5 .26). Затем строят кривую Михаэлиса-Ментон (Рис. 5 .27) и методом нелинейной регрессии рассчитывают микроскопические константы ферментативной реакции. И хотя полную картину можно получить, лишь зная все три микроскопических константы, часто ограничиваются расчетом V_макс и K_m. Максимальная скорость характеризует в основном фермент. Будучи поделенной [E]_o, на она дает независимую от концентрации (удельную) активность данного фермента. С другой стороны, константа Михаэлиса характеризует в основном субстрат. Часто рассматривают K_m как меру сродства субстрата к активному центру фермента. Сродство фермента к субстрату характеризуется константой равновесия межу ферментом и фермент-субстратным комплексом. В энзимологии обычно используют не константу образования, а обратную ей константу распада фермент-субстратного комплекса.

Рис. 5.28. Те же экспериментальные данные, что и на Рис. 5 .27 , отложенные в двойных обратных координатах.

( 5.0)

Чем меньше K_S, тем стабильнее фермент-субстратный комплекс.

Сравнение выражения для K_S [Уравнение ( 5 .0)] с выражением для константы Михаэлиса [Уравнение( 5 .0)] показывает, что K_m может служить мерой сродства субстрата к активному центру только тогда, когда k₂ пренебрежимо мала по сравнению с k_–1 (т.е. когда k_–1 >> k₂).

На практике для обработки экспериментальных данных чаще используют не само уравнение Михаэлиса-Ментон [Уравнение ( 5 .0)], а его линейную анаморфозу

( 5.0)

принято называть уравнением в двойных обратных координатах или уравнением Лайнуивера-Берка (см. Рис. 5 .28).

Для ферментов, строго подчиняющихся уравнению Михаэлиса-Ментон, график Лайнуивера-Берка представляет собой прямую линию. Из этого графика легко рассчитать и максимальную скорость, и константу Михаэлиса.

Как мы увидим дальше, графики в двойных обратных координатах с большой пользой применяются так же при изучении ингибирования ферментативных реакций.