Выявление днк по Фельгену
Реактивы:
1. Метиловый спирт.
2. 3N раствор HCl.
3. Реактив Шиффа.
4. 1N HCI.
Приготовление реактивов
1. 3N раствор HCl: 266,4 мл концентрированной HCl, до 1 литра — дистиллированная вода. Готовить в мерной колбе, хранить в холодильнике.
2. Реактив Шиффа.
3. Сернистая вода: 1,5 г —Na2S2O5, 15 мл — 1N HCl, 300 мл — дистиллированной воды.
Ход реакции
1. Препарат фиксируют в метаноле 15 мин.
2. Опускают в подогретый до 37 °С раствор 3N раствор соляной кислоты и помещают в термостат при 37 °С на 20 — 25 мин.
3. Промывают в отработанном реактиве Шиффа из холодильника.
4. Помещают в чистый реактив Шиффа при 37 °С на 45 — 60 мин.
5. Промывают в сернистой воде 3 раза по 3 мин.
6. Промывают в дистиллированной воде.
7. Высушивают на воздухе и заключают под покровное стекло в заливочную среду.
Этот метод используют для окраски ядер клеток и метафазных хромосом.
Для каждой ткани существуют свои особенности фиксации, проводки, заливки и окраски. Очевидно, что изготовление срезов костной ткани и нервной различается. В качестве красителей используются самые разнообразные вещества, наиболее распространены анилиновые красители. Своеобразным вариантом красителя являются соли серебра, которые восстанавливаются в ходе окрашивания до металлического серебра, придающего окраску структурам.
Метод замороженных срезов
Метод замороженных срезов, когда режутся нефиксированные образцы, применяется достаточно широко в клинической практике для экстренной диагностики, и в различных научных исследованиях. Для диагностики достоинством метода является быстрота приготовления срезов и возможность изучения тканей и клеток без предварительной фиксации и проводки. Необходимым условием использования этого метода является наличие криостата или замораживающего микротома. В криостате пониженная температура создается внутри всей камеры, а в замораживающем микротоме на нож и образец подается твердая углекислота.
Образцы обычно замораживают жидким азотом, затем в криостате готовят срезы. Кусочки укрепляют на держателе с помощью воды, иногда образец также погружают в воду и режут вместе со льдом, подобно парафиновому блоку. Срезы монтируют на стекло, затем обрабатывают в зависимости от задач исследования. Для рутинной диагностики срезы быстро фиксируют формалином, окрашивают и просматривают в микроскопе.
Спектр использования метода замороженных срезов очень широк. Гистохимия ферментов – одно из направлений. Оттаявшие срезы переносят в термостат, где и проводится реакция. Данный метод используют для выявления разных ферментов, активность которых не сохраняется при фиксации, в частности, различных дегидрогеназ. При работе этих ферментов генерируются электроны или протоны, которые связываются с акцептором-красителем. Краситель меняет цвет, окрашивая структуры, где локализован данный фермент. Наиболее распространены красители группы нитро-синего тетразолия, которые из желтых становятся синими или темно-фиолетовыми. Например, таким образом можно изучать уровень активности того или иного фермента в клетках при разных функциональных состояниях. Сукцинатдегидрогеназа – один из ферментов цикла Кребса.
Иммуногистохимия
Иммуногистохимия – выявление белков (антигенов) в тканях и клетках с помощью меченых антител. В настоящее время выделяется два основных направления иммуногистохимии: с использованием парафиновых и замороженных срезов. Несмотря на один и тот же основной принцип (реакция антиген-антитело), существует множество нюансов в использовании того или иного метода, и фирмы-производители выпускают антитела с пометкой «для парафиновых срезов», или – «для замороженных».
Иммуногистохимические методы в настоящее время очень широко распространены и используются не только в научной работе, но и в медицинской диагностике. Основной реактив, общий для всех иммуногистохимических методов - антитело. Способность специфических антител связываться с тканевыми белками обеспечивает возможность выявления этих белков в клетках и тканях. Суть любой иммуногистохимической реакции состоит в визуализации комплекса антиген-антитело.
Прямой метод.
Антиген связывается с антителом, которое конъюгировано с ферментом, в результате работы которого образуется окрашенный продукт. Хромоген – вещество, придающее окраску продукту реакции. Именно отложение хромогена и визуализирует антиген. В качестве ферментов чаще всего выступает пероксидза, обычно – пероксидаза хрена, которая, взаимодействуя с красителем, приводит к образованию окрашенного продукта. Используют также фосфатазы, которые могут давать окрашенные продукты.
Ферменты усиливают реакцию, увеличивая объем продукта. Единичный комплекс антиген-антитело, даже окрашенный, можно просто не увидеть из-за малых размеров.
В иммунофлуоресцентном варианте вместо фермента антитела связаны с флуоресцирующей меткой. Этот вариант выглядит проще, но возникает проблема интенсивности свечения – при малых количествах антигена можно не увидеть мечение. Прямой метод в настоящее время практически не используется в иммуногистохимии, поскольку дает очень слабый сигнал, недостаточный для выявления малых количеств белка в срезах клеток.