Центромеры

Центромеры – специализированные участки хромосом, отвечающие за правильное расхождение хроматид при делении клеток. Когда клетка входит в митоз, хроматин конденсируется, формируя метафазные хромосомы, состоящие из двух пар хроматид. Центромеры выглядят как суженные участки хромосомы.

Центромеры служат также местом прикрепления к хромосоме митотического веретена. В области центромеры находятся специальные участки ДНК, к которым присоединяются специальные белки, формируя кинетохор, к которому прикрепляются микротрубочки веретена. Веретено обеспечивает расхождение метафазных хромосом.

Именно метафазные хромосомы являются предметом генетического анализа в консультациях. Строение метафазных хромосом человека изучено в деталях. Есть специальные метода окрашивания – дифференциальное окрашивание хромосом. Современный вариант – применение высокоспецифичных флуоресцентно-меченых зондов - FISH–гибридизация.

Теломеры

Теломеры – участки на концах хромосом, которые играют важную роль в репликации ДНК. Было показано, что целостность теломеров необходима для репликации хромосом. ДНК-полимераза не может реплицировать концы линейной хромосомы. Для репликации теломерных участков существует специальный механизм, с участием обратной транскриптазы (теломеразы). Теломераза и гипотезы об ее роли в старении.

Клеточный цикл

Клеточный цикл состоит их 4-х стадий: рост клеток, дупликация ДНК, разделение хромосом по дочерним клеткам, деление клетки. У прокариот дупликация ДНК идет в течение всего клеточного цикла, и удвоенная хромосома попадает в дочернюю клетку с фрагментом мембраны, к которой она прикреплена. У эукариот дупликация ДНК – отдельная стадия клеточного цикла.

Типичный пример клеточного цикла – рост клеток в культуре. Если наблюдать процесс в микроскоп, то очевидно наличие митоза и интерфазы. Клетки делятся примерно раз в сутки, и митоз продолжается около часа. Т.е., основную часть «жизни» клетки проводят в интерфазе. Во время интерфазы хромосомы деконденсированы, и ядра выглядят однородными. С молекулярной точки зрения, интерфаза – период активного протекания биохимических реакций, когда происходит рост клетки, дупликация ДНК и подготовка к делению.

М – фаза митоза

G1-период – подготовка к дупликации ДНК, период высокой метаболической активности и роста клетки

S-период – фаза синтеза, - происходит репликация ДНК.

Реплисома – комплекс белков, реплицирующих ДНК. Реплисомы работают как молекулярные моторы, катализирую полимеризацию нуклеотидов, развертывание ДНК и синтез праймеров РНК, а также сборку белков на ДНК.

G2-период – продолжение роста клетки и подготовка к митозу

Продолжительность фаз клеточного цикла очень варьирует у разных клеток. Так, в культуре быстрорастущих клеток G1-период длится около 11 часов, S-период – около 8 часов, G2-период – около 4 часов, и М – 1 час. Для дрожжей период всего цикла составляет 90 минут. Еще более короткий цикл у ранних эмбриональных клеток – около 30 минут. Правда, при таком делении нет роста клеток, идет только дупликация ДНК и митозы (стадия дробления зиготы). Одновременно с этим, во взрослом организме имеется огромное число клеток, которые метаболически активны, но делятся очень редко.

Клетки можно обработать радиоактивным тимидином в течение 15-20 минут, затем его убрать, и после соответствующей обработки, визуализировать меченые клетки – в S-фазе. Это делается либо на парафиновых срезах, либо in vitro. Метод радиоактивной метки.

Дупликация органелл - сложный процесс, который должен обеспечить удвоение как митохондрий и пластид, окруженных двумя мембранами, так и одномембранных органоидов, включая аппарат Гольджи и ЭПР.

Полагают, что митохондрии имеют цикл, аналогичный клеточному циклу. На модели плазмодия с помощью радиоактивной метки было показано, что цикл деления митохондрий аналогичен клеточному циклу, а общая продолжительность митохондриального цикла репродукции соответствовала продолжительности клеточного цикла.

Органоиды с одномембранной оболочкой не имеют ДНК, однако у них тоже есть фазы роста и «покоя», фаза разделения между дочерними клетками.

Аппарат Гольджи в клетках животных и растений делится во время митоза: разделение идет по центру от цис-стороны в сторону транс-стороны, образуется два дочерних аппарата Гольджи. Не отмечено формирования специальных структур, связанных с делением АГ. И митохондрии, и аппарат Гольджи «распределяют» сами себя по дочерним клеткам.

На срезах клеток, как правило, имеется большое число структур ЭПР, и проследить их судьбу практически невозможно современными методами витальной и электронной микроскопии. Деление ЭПР изучали у одноклеточной бурой водоросли C. Merolae, в клетках которой ЭПР формирует ядерную оболочку и не распространяется в цитоплазму. У этой водоросли – закрытый митоз, и ядро делится на два после удвоения хромосом. Оболочка ядра делится вместе с ним. Механизм деления ЭПР в клетках с открытым митозом пока не установлен.

Интерфазное ядро.

Ядро в целом поляризовано: центромеры находятся на одном конце, а теломеры – на другом, отражая распределение хромосом в поздней анафазе.

Во-вторых, хромосомы не перепутаны между собой, каждая занимает свое пространство в ядре. В третьих, хромосомы контактируют с определенными участками ядерной оболочки. В целом расположение хромосом в интерфазе повторяет их расположение в митотическом ядре.

Пространственная локализация хромосомы в интерфазе играет важную роль в регуляции генов и их взаимодействии.

Митоз

Митоз – уникальное событие, когда происходит дезинтеграция оболочки ядра, исчезает ядрышко, а хроматин конденсируется до состояния хромосом. В результате митоза образуются два новых ядра, каждое – со своей оболочкой и ядрышком. Во время митоза между дочерними клетками должны разделиться все органоиды, а не только наследственный материал.

В период G2 завершены репликация ДНК и удвоение ядерных пор, ЭПР представлен цистернами и трубочками.

В профазе митоза происходит спирализация хромосом. Как правило, дезинтегрегация ядерной оболочки означает конец профазы митоза. Нужно отметить, что дезинтеграция ядерной оболочки – не всеобщее явление. Некоторые одноклеточные эукариоты (дрожжи, в частности) претерпевают т.н. «закрытый» митоз, без разрушения ядерной оболочки. У них сначала расходятся хромосомы, а потом делится ядро. У более высокоорганизованных эукариот митозы открытые, - происходит распад ядерной оболочки и последующее формирование новой.

Дезинтеграция ядерной оболочки: сначала распадаются ядерные поры, внешняя мембрана – мембрана ЭПР, она остается в составе ЭПР. Фрагменты внутренней мембраны присоединяются к трубочкам ЭПР, это доказано на уровне белков, именно к трубочкам. Таким образом, ядерная оболочка исчезает, остаются трубочки ЭПР, которые на ультратонких срезах выглядят в основном пузырьками.

Ядерная пластинка деполимеризуется. Наиболее понятен последний процесс. Ядерная пластинка образована фибриллярными белками ламинами, которые соединены в сеть. Процесс соединения связан с фосфорилированием молекул. При деполимеризации связи распадаются.

Поровые комплексы диссоциируют на отдельные субъединицы. Компоненты ядерных пор диспергированы в цитоплазме, кроме трех трансмембранных нуклеопоринов, которые вместе с другими белками ядерной оболочки встраиваются в ЭПР.

В профазе митоза ядерные поры «разобраны», ядерная оболочка интегрируется в ЭПР, ЭПР представлен трубочками. Центриоли локализуются у ядерной оболочки, микротрубочки участвуют в разрушении ЯО.

В прометафазе завершается компактизация хромосом, идет их пространственная организация в метафазную пластинку. Часть компонентов ядерных пор связывается с кинетохором и формируется веретено. На этой стадии вокруг хромосом нет мембран.

Метафаза: хромосомы выстраиваются по экватору клетки, хорошо видно митотическое веретено. Разделение хромосом.

Анафаза: расхождение хромосом при помощи микротрубочек митотического веретена.

Трубочки ЭПР ассоциируют с хроматином и нуклеопоринами, связанными с хроматином.

В эту стадию вовлечены мелкие ГТФазы Ran и фосфатазы. Из ЭПР рекрутируются мембранные трубочки и белки ядерной оболочки к хроматину, формируется ЯО.

На этой стадии большинство белков ядерной оболочки покидает ЭПР.

Поздняя анафаза/ранняя телофаза: формируется замкнутая ядерная оболочка с порами. Как только поры завершают формирование и становятся способны к транспорту, начинается рост ядерной оболочки, клетка переходит к периоду G1.

Конденсация хроматина и образование хромосом – другой важный процесс, происходящий во время митоза. Параллельно с образованием хромосом исчезает ядрышко. Несмотря на фундаментальное значение конденсации хромосом, его механизмы до конца не поняты.

Расхождение хромосом обеспечивается их перемещением посредством микротрубочек, образующих митотическое веретено.

Сборка ядерной оболочки – сложный процесс. Показано, что белки внутренней мембраны, находящиеся в трубочках ЭПР, специфические связываются с белками хроматина, и таким образом выстраиваются вокруг хромосом. Таким образом восстанавливается внутренняя мембрана оболочки ядра, и в связи с ней собираются ядерные поры. Сложнее представить процесс формирования наружной мембраны, для этого пока недостаточно данных. Критическим считают формирование именно внутреннего листка, которое поддерживается порами, а пор в оболочке ядра эукариотических клеток тысячи. Тем не менее, есть данные, что ядерная оболочка формируется после митоза только при наличии в клетке «нормального» ЭПР. Сборка ядерных пор и формирование ядерной оболочки координированы и инициируется нуклеопоринами, связанными с хроматином.

Телофаза: завершение образования ядерной оболочки, цитокинез.

Следует отметить, что число ядерных пор удваивается в интерфазе.

Формирование ядерной оболочки происходит очень быстро и является сложным процессом, который до конца не понят.

Вольты

С ядерными порами связаны сравнительно недавно (1986 г.) открытые в клетках эукариот структуры – Vaults (вольты). Они были обнаружены при изучении фракций опушенных пузырьков методом негативного контрастирования.

Вольты имеют веретеновидную форму, тонкую (20 А) стенку (полые внутри). Название «Vaults» получили из-за сходства с куполом собора, которое усмотрели исследователи. Вольты локализуются в цитоплазме клеток в значительном количестве (около 10 000 на клетку у млекопитающих), перемещаются путем диффузии. Показана связь вольтов с поровыми комплексами ядра. Есть точка зрения, основанная на экспериментальных данных, что центральная пробка пор представлена именно вольтами.

Вольты являются самыми крупными рибонуклеиновыми структурами клеток, найденными на сегодняшний день, их размеры около 40 х 70 нм. Вольты имеют три белка. Основной компонент вольтов – основной белок (MVP) 110 кДа, есть еще два минорных белка: 193 кДа поли(АДФ-рибоза) полимераза (vPARP), и белок, связанный с теломеразой, 240 кДа (TEP-1). Интересным является то, что белок р240 вольтов идентичен связанному с теломеразой белку 1 (ТЕР1), т.е., данный белок входит в оба рибонуклеопротеиновых комплекса – и в вольты, и в теломеразный комплекс. Этот белок связывает РНК вольтов и необходим для обеспечения стабильности вольтов в целом. В состав вольтов входит также, как минимум, одна маленькая нетранслируемая РНК. Полагают, что РНК вольтов имеет скорее функциональное значение, нежели несет структурные функции.

Функции вольтов точно не установлены, однако их локализация в клетке позволяет полагать участие этих структур в процессах внутриклеточного транспорта, в том числе – между ядром и цитоплазмой. Полагают, что вольты участвуют в транспортных механизмах, передаче сигналов и развитии иммунного ответа. Вольты считают также прогностическими маркерами многих видов рака. Есть данные, что основной белок вольтов связан с множественной лекарственной устойчивостью, и уровень его экспрессии является прогностическим для клинического исхода после химиотерапии различных опухолей. Есть данные, что уровень экспрессии основного белка вольтов является полезным прогностическим маркером устойчивости к радиотерапии. Недавно были опубликованы данные о связи основного белка вольтов и самих вольтов, соответственно, с инсулино-подобным фактором роста-1, индуцируемым гипоксией фактором -1 альфа, и двумя механизмами репарации ДНК (non-homologous endjoining and homologous recombination).

При изучении репродукции листерии было обнаружено, что она захватывает оснвоной белок вольтов и таким образом предотвращает развитие аутофагоцитоза.

Увеличение содержания вольтов показано при отравлении клеток ксенобиотиками, полагают, что вольты участвуют в процессах «очистки» клеток, выбрасывая «отраву» наружу.

Большое количество вольтов выявляется в раковых клетках и клетках, обладающих множественной лекарственной устойчивостью.

Опубликовано много работ, посвященных изучению макромолекулярной организации вольтов, их структура достаточно хорошо изучена с помощью электронной микроскопии и томографии. Разработаны рекомбинантные системы, позволяющие получать препараты вольтов. Проводятся исследования по использованию вольтов в качестве доставщиков лекарственных препаратов, - по структуре вольты являются естественными нанокапсулами.

Протеасомы

Стабильность белков и время их жизни является важным параметром различных клеточных процессов. Клетке необходимо не только своевременно синтезировать новые белки, но и разрушить «отработавшие», или синтезированные «с ошибками». Время жизни свыше 20% белков в организме – от нескольких часов до нескольких дней. Разрушение белков происходит в лизосомах и протеасомах - в лизосомах разрушаются внеклеточные и мембранные белки, а в протеасомах разрушаются внутриклеточные белки, не связанные с мембранами. В клетке находится несколько тысяч протеасом, расположенных в нуклеоплазме и цитоплазме, но не в других органоидах. В протеасомах разрушается до 90% всех клеточных короткоживущих белков (с регуляторными функциями) и 60-70% долгоживущих белков

Протеасомы выделяют в виде отдельных частиц с коэффициентами седиментации 20S и 26S. 20S частица является коровой частью 26S частицы, которая обладает протеолитической активностью.

Протеасома построена из центрального кора, состоящего из 14 белковых димеров, по 7 в кольцевой структуре. Всего - 4 кольца, расположенных друг над другом. Эти белки по сути – протеазы, протеолитические сайты расположены внутри протеасомы. Две регуляторные части с двух сторон от кора, 14 белков в каждой, 6 из которых ATP-азы. Некоторые из субъединиц узнают убиквитин - белок, состоящий из 76 аминокислот.

История открытия механизмов деградации белков в протеасомах началась со «случайности» - начав изучать процессы разрушения внутриклеточных белков, Кичановер, Хершко и Роуз обратили внимание на то, что при расщеплении белков в клетке энергия не выделяется, а поглощается: демонтаж клеточных белков протекал только в присутствии АТФ, а в отсутствие АТФ расщепления не было. В тоже время было известно, что процессы расщепления белков в пищеварительном тракте (вместе с остальными продуктами) протекают с выделением энергии. Было проведено детальное изучение этого явления и установлено, что белки в клетке разрушаются не только при участии АТФ, но и в присутствии еще одного белка, обладающего высокой активностью, - убиквитина.

Решающая стадия в процессе утилизации белков – присоединение убиквитина к тому белку, который нужно уничтожить. Кроме того, обнаружилось, что вход в протеасому обычно закрыт, и попасть в нее может только белок, отмеченный специальной меткой, в этом случае вход в протеасому открывается. Роль такой «черной» метки играет убиквитин. Этот процесс прикрепления убиквитина к молекуле белка, подлежащего ликвидации, авторы назвали «поцелуем смерти».

Входя в протеасому, полимерная цепь уничтожаемого белка разворачивается и «протягивается» через центральный канал цилиндра, при этом она гидролизуется и распадается на мелкие звенья (иногда вплоть до отдельных аминокислот), которые выводятся из противоположного отверстия протеасомы. Сам убиквитин внутрь протеасомы не заходит, а после уничтожения отмеченной молекулы освобождается и начинает «метить» другую молекулу. В некоторых случаях к уничтожаемому белку присоединяется не одиночная молекула убиквитина, а сразу несколько молекул, связанные между собой, как бусины на нитке.

Перед присоединением к белку, который следует устранить, убиквитин активируется с помощью специального фермента, именно на этой стадии требуется дополнительная энергия (АТФ). Таким образом, получил объяснение тот факт, с которого и началось изучение всего этого механизма.

Результаты проведенных исследований позволили понять некоторые неразгаданные ранее особенности развития живых организмов. Например, растения в цветке содержат как отцовские клетки (пыльца), так и материнские (расположены в пестике цветка). Поскольку они рядом, то, казалось бы, самоопыление неизбежно, а это должно приводить к генетическому вырождению и вымиранию вида. Оказалось, что убиквитин помечает белки собственной пыльцы, что приводит к их уничтожению, а пыльца, попавшая в цветок в результате перекрестного опыления, убиквитином не затрагивается.

В процессе деления клетки ее ДНК удваиваются, все это время специальный белок наподобие шнура удерживает рядом друг с другом удваивающуюся пару. После удвоения молекулы ДНК должны разойтись, следовательно, белок, удерживающий их вместе, должен быть уничтожен, иначе процесс дальнейшего развития остановится. В этот момент включается убиквитин, ответственный за удаление ненужных белков.

Понятый убиквитиновый механизм открывает новые перспективы в борьбе с различными заболеваниями. Образование злокачественных образований или ослабление иммунной системы клетки связаны с нарушением убиквитиновой защиты клетки от нежелательных белков. Процессы ненормального или неправильного расщепления белков приводят ко многим заболеваниям (например, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, некоторые онкологические заболевания) и связаны с процессами старения организма. Изученный механизм убиквитиновой защиты открывает возможность поиска различных воздействий на этот механизм, чтобы запускать его в нужную сторону. Например, затормозить действие убиквитина можно, снизив концентрацию АТФ, поставляющего энергию, необходимую для протекания процесса. По существу, это использование того эффекта, с открытия которого начались исследования. Возможны и другие способы воздействия на процесс. Сейчас ведутся интенсивные разработки различных лекарственных препаратов, основанные на понимании механизма убиквитиновой защиты. В 2004 в США было начато производство первого такого препарата – антиракового средства Velcade.

Таким образом, в клетках существует две системы деградации белков – лизосомы и протеасомы, обеспечивающие расщепление (протеолиз) белковых макромолекул.