3. Культивирование вирусов

Основные методы культивирования вирусов:

1) биологический – заражение лабораторных животных. При заражении вирусом животное заболевает. Если болезнь не развивается, то патологические изменения можно обнаружить при вскрытии. У животных наблюдаются иммунологические сдвиги. Однако далеко не все вирусы можно культивировать в организме животных;

2) культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах. Куриные эмбрионы выращивают в инкубаторе 7—10 дней, а затем используют для культивирования. В этой модели все типы зачатков тканей подвержены заражению. Но не все вирусы могут размножаться и развиваться в куриных эмбрионах.

В результате заражения могут происходить и появляться:

1) гибель эмбриона;

2) дефекты развития: на поверхности оболочек появляются образования – бляшки, представляющие собой скопления погибших клеток, содержащих вирионы;

3) накопление вирусов в аллантоисной жидкости (обнаруживают путем титрования);

4) размножение в культуре ткани (это основной метод культивирования вирусов).

Различают следующие типы культур тканей:

1) перевиваемые – культуры опухолевых клеток; обладают большой митотической активностью;

2) первично трипсинизированные – подвергшиеся первичной обработке трипсином; эта обработка нарушает межклеточные связи, в результате чего выделяются отдельные клетки. Источником являются любые органы и ткани, чаще всего – эмбриональные (обладают высокой митотической активностью).

Для поддержания клеток культуры ткани используют специальные среды. Это жидкие питательные среды сложного состава, содержащие аминокислоты, углеводы, факторы роста, источники белка, антибиотики и индикаторы для оценки развития клеток культуры ткани.

О репродукции вирусов в культуре ткани судят по их цитопатическому действию, которое носит разный характер в зависимости от вида вируса.

Основные проявления цитопатического действия вирусов:

1) размножение вируса может сопровождаться гибелью клеток или морфологическими изменениями в них;

2) некоторые вирусы вызывают слияние клеток и образование многоядерного синцития;

3) клетки могут расти, но делиться, в результате чего образуются гигантские клетки;

4) в клетках появляются включения (ядерные, цитоплазматические, смешанные). Включения могут окрашиваться в розовый цвет (эозинофильные включения) или в голубой (базофильные включения);

5) если в культуре ткани размножаются вирусы, имеющие гемагглютинины, то в процессе размножения клетка приобретает способность адсорбировать эритроциты (гемадсорбция).

1. Характеристики тканевых культур 2. Цитопатическое действие вирусов

1.ДЛЯ культивирования вирусов используют ряд методов. Это культивирование в организме экспериментальных животных, развивающихся куриных вибрионах и культурах тканей (чаще — эмбриональные ткани или опухолевые клетки). Для выращивания клеток тканевых культур используют многокомпонентные питательные среды (среда 199, среда Игла и др.). Они содержат индикатор измерения рН среды и антибиотики для подавления возможного бактериального загрязнения. Культуры тканей могут быть переживающими, в которых жизнеспособность клеток удается сохранить лишь временно, и растущими, в которых клетки не только сохраняют жизнедеятельность, но и активно делятся. В роллерных культурах клетки ткани фиксированы на плотной основе (стекло) — чаще в один слой (однослойные), а в суспензированных —взвешены в жидкой среде. По количеству пассажей, выдерживаемых растущей культурой тканей, среди них различают: • первичные (первично-трипсинизированные) культуры тканей, которые выдерживают не более 5—10 пассажей; • полуперевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются не более чем в 100 генерациях; • перевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются в течение неопределенно длительного срока в многочисленных генерациях. Чаще всего используются однослойные первично-перевиваемые и перевиваемые тканевые культуры. 2. О размножении вирусов в культуре ткани можно судить по ци-топатическому действию (ЦПД): • деструкции клеток; • изменению их морфологии; • формированию многоядерных симпластов или синтиция в результате слияния клеток. • в клетках культуры ткани при размножении вирусов могут образовываться включения — структуры, не свойственные нормальным клеткам. Включения выявляются в окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках из зараженных клеток. Они бывают эозинофильные и базофильные. По локализации в клетке различают: • цитоплазматические; • ядерные; • смешанные включения. Характерные ядерные включения формируются в клетках, зараженных вирусами герпеса (тельца Каудри), цитомегалии и полиомы, аденовирусами, а цитоплазматические включения — вирусами оспы (тельца Гварниери и Пашена), бешенства (тельца Бабеша-Негри) и др. О размножении вирусов в культуре ткани также можно судить по методу «бляшек» (негативных колоний). При культивировании вирусов в клеточном монослое под агаровым покрытием на месте пораженных клеток образуются зоны деструкции моно-сом — так называемые стерильные пятна, или бляшки. Это дает возможность не только определить число вирионов в 1 мл среды (считается, что одна бляшка является потомством одного вириона), но и дифференцировать вирусы между собой по феномену бляшкообразования. Следующим методом, позволяющим судить о размножении вирусов (только гемагглютинирующих) в культуре ткани, можно считать реакцию гемадсорбции. При культивировании вирусов, обладающих гемагглютжирующей активностью, может происходить избыточный синтез гемагглютининов. Эти молекулы экспрессируются на поверхности клеток культуры ткани, и клетки культуры ткани приобретают способность адсорбировать на себе эритроциты — феномен гемадсорбции. Молекулы гемагглютинина накапливаются и в среде культивирования, это приводит к тому, что культуральная жидкость (в ней накапливаются новые вирионы) приобретет способность вызывать гемагглютинацию. Наиболее распространенным методом оценки размножения вирусов в культуре ткани является метод «цветной пробы». При размножении в питательной среде с индикатором незараженных клеток культуры ткани вследствие образования кислых продуктов метаболизма она изменяет свой цвет. При репродукции вируса нормальный метаболизм клеток нарушается, кислые продукты не образуются, среда сохраняет исходный цвет.