Генерация no и механизм его действия
В клетках эндотелия кровеносных сосудов оксид азота NO производится непрерывно в ходе ферментативной реакции аминокислоты L-аргинина с молекулярным кислородом. Реакция идет под действием специального фермента, называемого NO-синтазой, в присутствии ко-фактора реакции NADPH — никотинамидаденин динуклеотидфосфата — и некоторых других. [5-9]. Если L-аргинин, кислород и ко-факторы доступны в достаточном количестве, активация NO-синтазы приводит к увеличению концентрации оксида азота.
Упрощенная схема реакции показана на рисунке.
Аминокислота L-аргинин через систему кровообращения доставляется в каждую клетку тела. Часть L-аргинина участвует в синтезе NO, другая часть — в синтезе белков. Кислород является одним из субстратов, необходимых для синтеза NO и важным фактором, определяющим активность NO-синтазы.
Далее NO диффундирует в клетки гладкой мускулатуры кровеносных сосудов, окружающих эндотелий, и активирует цепь биологических реакций, вызывающих расслабление мускулатуры сосудов и увеличение кровотока.
Регуляция активности NO-синтазы осуществляется, в том числе, и с помощью обратной связи по конечному продукту. Оксид азота способен взаимодействовать с NO-синтазой, снижая ее активность. Это один из путей, которыми достигается жесткая регуляция синтеза NO, что предупреждает его повреждающее действие на ткани.
Детальные исследования процесса генерации оксида азота показали, что в организме существует несколько разновидностей NO-cинтаз (NOS) — ферментов, катализирующих образование оксида азота NO при окислении аминокиcлоты L-аpгинина. В настоящее время идентифицированы три изоформы NOS, названия которых соответствуют названиям клеток, в которых они были впервые обнаружены [3]: NOS-1 — нейрональная (nNOS), или мозговая (bNOS); NOS-2 — индуцибельная (iNOS), или макрофагальная (mNOS); NOS-3 — эндотелиальная (eNOS).
Хотя все изоформы NOS катализируют образование NO, каждая из них имеет свои особенности в локализации, механизмах действия и в биологическом значении для организма. Поэтому изоформы NOS принято также подразделять на конститутивную (cNOS) — это nNOS и еNOS, постоянно присутствующие в клетке и меняющие лишь свою активность, и индуцибельную (iNOS) синтазы оксида азота, концентрация которой определяется внешним воздействием.
Цепочку взаимодействий от генерации NO до расширения сосудов иллюстрирует схема .
Конститутивная NO-синтаза (cNOS) постоянно находится в цитоплазме клеток эндотелия. Внеклеточные гормоны и другие агенты, взаимодействуя с поверхностными клеточными рецепторами и сенсорами, открывают кальциевые каналы клетки, и ионы Ca2+ из внеклеточного пространства, где их концентрация в тысячи раз больше, чем внутри клетки, проникают в клетку. Здесь они быстро связываются с внутриклеточным белком — кальмодулином, образуя активный комплекс Ca2+-кальмодулин. Кальмодулин обнаружен почти во всех клетках организма. Он постоянно присутствует в клетке и действует как внутриклеточный рецептор ионов кальция Са2+, чувствительный к малейшим изменениям их концентрации.
Активированный комплекс Са2+-кальмодулин, в свою очередь, соединяется с конститутивной NO-синтазой, повышая ее активность. Активированная NO-синтаза стимулирует генерацию оксида азота в реакции, схема которой представлена на рис. 1.
Как только концентрации свободных ионов кальция в цитозоле эндотелиальной клетки падает, комплекс Са2+-кальмодулин диссоциирует, инактивируя NO-синтазу. Поэтому конститутивные NO-синтазы называют еще и кальцийзависимыми.
Факторами, активизирующими эндотелиальные клетки, наряду с гормонами и тромбоцитами, циркулирующими в кровеносных сосудах, могут быть механические усилия, изменения скорости кровотока, гипоксия (кислородная недостаточность) и другие. В покое эндотелий под действием пульсирующего кровотока постоянно секретирует определенные количества NO, поддерживая нормальный тонус и оптимальный диаметр сосудов.
Образовавшийся NO диффундирует через клеточные мембраны в соседние гладкомышечные клетки сосудов, окружающие эндотелий, активирует в них фермент — гуанилатциклазу, который, в свою очередь, стимулирует синтез циклического гуанозинмонофосфата — цГМФ из гуанозинтрифосфата — ГТФ. Циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ) является универсальным внутриклеточным регулятором. Рост концентрации цГМФ приводит,,через цепочку внутриклеточных взаимодействий, к расслаблению гладких мышц и расширению сосудов.
Уровень цГМФ контролируется также другим внутриклеточным ферментом — фосфодиэстеразой (ФДЭ), которая катализирует деградацию цГМФ. Соотношение активностей двух ферментов — гуанилатциклазы и ФДЭ — и определяет равновесную концентрацию цГМФ и равновесный тонус сосудов. Ингибируя фермент ФДЭ, можно поддерживать высокую концентрацию цГМФ и расширение сосудов. Так, кстати, действует известный препарат — виагра.
Под влиянием конститутивной NOS образуются очень малые количества NO, которые измеряются пикомолями (пкМ), но этого количества достаточно для осуществления местной регуляции в нормальных физиологических условиях.Выделяемые локально небольшие количества NO, не задействованные в активации гуанилатциклазы, диффундируют внутрь сосудистой стенки и в тромбоциты, которые циркулируют на периферии потока крови на небольшом расстоянии от эндотелия.В просвете сосуда NO быстро инактивируется растворенным кислородом и гемоглобином. Эти эффекты предотвращают действие NO на большом расстоянии от места его высвобождения, что характеризует оксид азота как локальный регулятор сосудистого тонуса.
Индуцибельная NOS (NOS-2) появляется в клетках только через несколько часов после индукции бактериальными эндотоксинами и некоторыми медиаторами воспаления. Количество NO, образующегося под влиянием iNOS, почти в 1000 pаз больше, чем генерируемое под влиянием cNOS, и может достигать наномолей (нМ). При этом генерация NO сохраняется дольше. Одно из возможныx физиологичеcкиx назначений этого пpоцеccа — защитное дейcтвие окиcи азота в условиях травмы или какой-либо патологии, заключающееся в подавлении активности бактериальных и опухолевых клеток [8]. Защитное действие NO в подобных ситуациях проявляется во взаимодействии с супероксид-анионом кислорода (О2) с образованием пероксинитрита:
NO + О2· → ONOO-
Оксид азота присутствует во всех эндотелиальных клетках, независимо от размера и функции сосудов. В покое эндотелий постоянно продуцирует небольшие количества NO, поддерживая нормальный тонус сосудов (так называемый базовый фон).
Внеклеточные гормоны и другие агенты, взаимодействуя с поверхностными клеточными рецепторами, активируют сNOS, которые генерируют выделение небольшого количества NO на короткий период в ответ на рецепторную и физическую стимуляцию.
При различных воздействиях — физических (УФ-излучение, термическое воздействие), механических (например, при усилении тока или пульсации крови), химических, бактериальных и вирусных (опосредуемых микробными липополисахаридами и различными цитокинами, выделяющимися из лимфоцитов и кровяных пластинок) — синтез NO в эндотелиальных клетках значительно повышается.
В нормальных физиологических условиях, когда стационарная концентрация активных форм кислорода невелика, и регулируется антиоксидантами, и при ничтожно малой концентрации оксида азота порядка пкМ, через образование пероксинитрита выполняется важная роль NO как регулятора апоптоза — программируемой гибели дефектных клеток. Оксид азота, проникая через клеточные мембраны, инициирует апоптические процессы внутри клетки, которые происходят без нарушения целостности мембраны и не распространяются на соседние клетки, в отличие от некроза — массовой гибели клеток при воспалении.
Патологические ситуации характеризуются значительным, на несколько порядков, ростом в очаге воспаления концентрации как NO, так и О2-. Известно, что активированные макрофаги выделяют и NO, и О2-, которые являются важными медиаторами воспаления. Образующийся при этом пероксинитрит реализует важный защитный механизм, лежащий в основе неспецифического иммунитета.Однако при воспалительных и апоптотических реакциях выявлено кроме токсического, также защитное действие NO. Это связано, видимо, как с непосредственной активацией соответствующих звеньев цепочек реагентов, так и с усилением микроциркуляции как одной из фором защитной реакции
Таким образом, оксид азота NO, продуцируемый различными изоформами NOS, оказывает чрезвычайно важное и разнообразное действие на многочисленные физиологические процессы в организме. Сочетание генерации оксида азота разными изоформами фермента, отличающимися временем генерации (от минут до часов и дней) и количеством генерируемого NO (от пкМ до нМ), позволяет своевременно и гибко реагировать на происходящие в организме изменения.
Роль NO в ответных реакциях клеток и систем организма на воздействие внешних факторов определяется соотношением стрессовых факторов и факторов выживания клетки.
Сейчас хорошо известно, что NO способен синтезировать не только эндотелиальные клетки сосудов, но и другие клетки, в частности, макрофаги и фибробласты кожи, и он является одним из основных регуляторов внутриклеточных процессов.