Порядок выполнения работы

Метод основан на извлечении хлорофилла из листьев раство­рителями (спирт, ацетон) и определении его количества на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре. При работе с сухим материалом берут навеску 0,5-1 г, со све­жим – 1-2 г. На­веску растительного материала (исключая жилки) тщательно измельчают в фарфоровой ступке с битым стеклом. Извлечение хлорофилла из сухого мате­риала можно производить 90%-ным спиртом или 80-85%-ным аце­тоном, а из свежего – 96-98%-ным спиртом или абсолютным ацетоном. К растертому растительному материалу прибавляют немного растворителя и материал продолжают растирать вместе с раствори­телем.

Жидкость из ступки слива­ют в колбу объемом 50 см³. В ступку приливают 4-5 мл растворителя и вновь растирают в течение минуты, затем опять сливают в колбу. Эту манипуляцию повторяют 2-3 раза. Ступку ополаскивают несколько раз растворителем, выливая его в колбу. Промывание ведут до тех пор, пока стекающий раствор не станет бесцветным. Затем эк­стракт переносят в «пальчики» центрифуги и центрифугируют в течение 5 минут при 3000 об./сек. После чего надосадочную жидкость переносят в колбу на 100 см³ и вытяжку доводят до черты растворителем. Колориметрирование раствора производят на ФЭКе с красным светофильтром. Если жидкость окрашена в интенсивно зеленый цвет, ее необходимо разбавить, так как при больших концентрациях величины на ФЭКе могут выходить за пре­делы разрешающей способности прибора.

Для пересчета хлорофилла на стандартные величины использу­ют раствор Гетри, который готовится следующим образом: в мерную колбу емкостью 100 мл точ­но отмеривают растворы (1%-ный раствор CuSO₄·5Н₂О – 28,5 мл, 2%-ный раствор К₂Сг₂0₇ – 50 мл, 7%-ный раствор NH₄ОH – 10 мл), доводят дистиллированной водой до метки и пере­мешивают. Раствор Гетри по окраске колориметрически эквивалентен ра­створу кристаллического хлорофилла по содержанию последнего 85 г/л.

Методом разбавления стандартного раствора строят калибровоч­ную кривую, где по оси абсцисс откладывают содержание хлорофил­ла (мг/л), а по оси ординат – оптическую плотность. Калибровочную кривую строят от концентрации 0,085 мг/л (1 мл исходного раство­ра и 99 мл воды) до 0,85 мг/л (10 мл исходного раствора и 90 мл воды). Измерения на ФЭКе производят несколько раз, затем вычисляют среднее.

Требования к отчету

По полученным данным определяют концентрацию хлоро­филла в опытных образцах по калибровочной кривой. Затем вычис­ляют количество хлорофилла в мг/г листа (по сырой или сухой массе). В насаждениях сосны оно колеблется от 0,08 до 0,14 мг/г. Можно так­же выразить количество хлорофилла в процентах (0,3-1,3% абсолют­но сухой массы листа). Схема записи результатов анализов приведена ниже (табл. 5).

Таблица 5

Результаты анализа

Опыт	Навес­ка, мг	Объем вытяж­ки, мл	Показа­ния ФЭКа	Количество хлорофилла по калибровочной кривой, мг/100 мл		Содержание хлорофилла в листьях
						мг/г	%