![](/user_photo/2706_HbeT2.jpg)
- •Изучение фотодинамического действия света на клеточные структуры
- •1. Введение.
- •2. Краткие сведения из теории.
- •3. Характерные особенности изучаемых в работе фс.
- •4. Выбор длины волны излучения при фдт.
- •5. Экспериментальное моделирование фдэ.
- •6. Экспериментальное оборудование, материалы и расчёты.
- •Выполнение работы.
- •7. Используемое оборудование и материалы.
- •8. Порядок выполнения работы.
- •9. Контрольные вопросы.
- •Математическое описание фдэ.
- •Литература.
6. Экспериментальное оборудование, материалы и расчёты.
Экстинкция суспензии эритроцитов измеряется на фотоколориметре (приборе, измеряющем оптическую плотность на различных длинах волн). Используемый в лабораторной работе колориметр КФК-2 позволяет проделывать это на 9 длинах волн от 315 до 750 нм. Тем самым можно, хотя и грубо, но построить кривую спектра пропускания исследуемых жидких препаратов. Величина пропускания Т определяется отношением прошедшего через образец потока излучения I к падающему потоку I0 , приведенными к одному и тому же поперечному сечению:
(2)
Для корректности определения Т оптическая схема колориметра содержит коллиматор и диафрагмы, обеспечивающие квазипараллельность проходящего через образец пучка излучения. Поскольку как спектральная интенсивность источника, так и спектральная чувствительность приемника зависят от длины волны, в приборе используется калибровочный канал, в который помещается кювета, заполненная растворителем (в данном случае, физраствором, оптическая плотность которого в рассматриваемом интервале длин волн мало отличается от водяной). Измерение Т на каждой длине волны производится в 2 приема: сначала в луч вводится калибровочная кювета, и с помощью регулировки чувствительности приемного канала показания прибора устанавливаются на Т = 1 (шкала отградуирована в процентах). После этого прибор переключается на измерительный канал (калибровочная кювета выводится из луча и точно на ее место помещается измерительная кювета с испытуемой жидкостью). При правильной калибровке (100% пропускания при открытом окне фотоприемника и 0% при закрытом) показания прибора дают величину искомого пропускания. Против шкалы пропускания (равномерная от 0 до 100%) нанесена шкала оптических плотностей Д (логарифмическая) в соответствии с формулой
Д = lg T (3)
Величина Д меняется в пределах от 0 (Т = 1) до (Т = 0), однако фактическая возможность измерения Д определяется ценой деления шкалы. Так, при Т =0,1 Д = 1; при Т = 0,01 Д = 2; производить измерения с точностью, превы-
р
шающей 1% по Т, нереально, причем при малых пропусканиях (Т 10%) ошибка резко возрастает. Поэтому реальным диапазоном измерения Д является 0 Д 2. По этой причине фактическая возможность абсолютного измерения концентрации исследуемого вещества по оптической плотности, в соответствии с формулой Ламберта-Бера
Д = сL (4)
где
с – концентрация,
- коэффициент молярной экстинкции,
L – толщина
образца (длина оптического пути излучения
в испытуемой среде), затруднена. Однако
относительная
концентрация выживших частиц
в зависимости от времени облучения t
и дозы
облучения D,
имеющей
смысл суммарной падающей на исследуемый
пул клеток энергии излучения, может
быть найдена на основе предложенной в
МГУ им. М.В. Ломоносова [3] и развитой в
МГТУ им. Н.Э. Баумана математической
модели (см. приложение 1). Простейший
вариант этой модели основан на
предположениях о пренебрежении
репаративными процессами, преобладании
химического механизма тушения, отсутствии
кислородного голодания и определении
доли выживших клеток сразу после
прекращения облучения. Результатом
расчета при таких предположениях будет
следующая зависимость относительной
концентрации от дозы:
(5)
Здесь
обозначено
t = D – доза
воздействующего излучения,
-
постоянная, характеризующая скорость
гибели сенсибилизированных клеток в
начальный момент облучения. Найденная
зависимость (5), будучи построенной в
координатах (
),
и называется дозовой
кривой.
Коэффициент
характеризует крутизну этой кривой
(см. приложение 1). В
виде дозовой
кривой можно представить и экспериментальные
данные. Пример
дозовой кривой приведён на рис. 9.
Поскольку в
дозовую кривую (5), определяющую зависимость
ln
от дозы облучения, входит не абсолютная
концентрация сенсибилизированных
частиц, а относительная, приводить в
соответствие измеряемую оптическую
плотность Д
с абсолютной молярной концентрацией с
нет необходимости, тем более, что
коэффициент молярной экстинкции
априори
неизвестен.
Рис.8. Схема экспериментальная установки для наблюдения ФДЭ на взвеси эритроцитов: 1 – источник света, 2 – конденсор, 3.6.8 – диафрагмы; 4 – коллиматор; 5 – сменные интерференционные фильтры; 7 – кювета с исследуемой жидкостью; 9 – светоделительная пластинка; 10 – фотодиод; 11 – фотоэлемент; 12 – усилитель постоянного тока; 13 – измерительный прибор.
Рис.9. Расчётные дозовые кривые в предположении о преобладании химического механизма тушения.
Правильное построение дозовых кривых для ФДЭ должно содержать: а) выбор концентрации эритроцитов в суспензии в соответствии с исходным пропусканием образца в пределах Т = 2030%, чтобы диапазон изменения пропускания при гемолизе эритроцитов был велик по сравнению с исходной величиной пропускания; б) выбор концентрации ФС, достаточно большой для обеспечения полного поражения всех эритроцитов в образце, но при этом достаточно малой для того, чтобы исходное пропускание образца с добавленным ФС не сильно отличалось от несенсибилизированного (т.е. находилось в пределах тех же 2030%); в) обязательное измерение характеристик контрольного образца, выдерживаемого параллельно с облучаемым в темноте, с тем, чтобы выделять при каждом измерении ту оптическую плотность, которая определяется именно ФДЭ, а не всеми прочими причинами. Основной серии измерений, позволяющих построить дозовую кривую, должны предшествовать 2 серии предварительных измерений: а) спектральной характеристики пропускания суспензии эритроцитов (несенсибилизированной); б) спектральной характеристики пропускания раствора ФС. Эти кривые позволяют определить как предпочтительную длину волны источника засветки, так и длину волны, на которой следует вести измерения Т и Д для наиболее заметного проявления ФДЭ. Очевидно, что первая должна быть близка к максимуму поглощения ФС, вторая – к максимуму экстинкции суспензии эритроцитов. Доза облучения (в относительных единицах) определяется посредством измерения времени облучения. В качестве контрольного, как в начале, так и по окончании опыта, следует провести измерение плотности потока излучения (освещенности), даваемой используемым источником. Это необходимо для того, чтобы можно было считать зависимость дозы D облучения от времени t линейной (обеспечение линейности, согласно формулам (13) и (5), имеет место только при I0 = const).