9. Культуральный метод исследования
9.1. Принципиальная схема культурального метода исследования
Содержание культурального метода исследования, естественно, зависит от того вида микроорганизмов, который в его процессе выделяется и идентифицируется. Однако в принципе все виды бактерий выделяются и идентифицируются по единому алгоритму, состоящему из трех этапов. Содержимое этих этапов значительно отличается лишь в случае анаэробных бактерий. При выделении спороносных бактерий (бацилл и клостридий) проводится предварительная процедура, отсутствующая в случае работы с бактериями, не образующими спор.
А. Цель предварительного этапа – выделение из патологического материала спороносных бактерий.
1. Из имеющих медицинское значение аэробных и факультативно-анаэробных бактерий спорами обладают бациллы.
а. На предварительном этапе патологический материал микроскопируется. Бациллы, благодаря наличию споры, не превышающей диаметр бактериальной клетки, можно по мазку идентифицировать до рода. Однако, поскольку в организме человека и животных бациллы спор не образуют, в патологическом материале, представляющем собой жидкости или ткани живого организма, бактерий со спорами можно и не обнаружить. Другими словами, микроскопия патологического материала в данном случае имеет только ориентировочное значение.
б. Затем патологический материал, предварительно разделив на две порции, засевают в жидкую питательную среду.
1. Первая порция засевается после предварительного прогревания примерно 15 минут при 800С. В этих условиях вегетативные бактериальные клетки погибают, а споры – нет. Вырасти после такой обработки может только спороносные бактерии.
2. Вторую порцию патологического материала засевают на питательную среду без всякой предварительной обработки – в нативном виде. Если спороносную культуру не удастся выделить из первой порции, придется выделять ее из смешанной культуры, выросшей в результате засева нативного патологического материала.
2. Из имеющих медицинское значение строгих и аэротолерантных анаэробных бактерий спорами обладают клостридии.
а. На предварительном этапе патологический материал микроскопируется. Клостридии, благодаря наличию споры, превышающей диаметр бактериальной клетки, можно по мазку идентифицировать до рода. Однако, поскольку в организме человека и животных клостридии, как и бациллы, спор не образуют, в патологическом материале, представляющем собой жидкости или ткани живого организма, бактерий со спорами можно и не обнаружить. Другими словами, микроскопия патологического материала и в данном случае имеет только ориентировочное значение.
б. Затем патологический материал, предварительно разделив на две порции, засевают в среду Кита-Тароцци, действуя аналогично выделению бацилл.
1. Первая порция засевается после предварительного прогревания примерно 15 минут при 800С. В этих условиях вегетативные бактериальные клетки погибают, а споры – нет. Вырасти после такой обработки может только культура спороносных бактерий.
2. Вторую порцию патологического материала засевают на питательную среду без всякой предварительной обработки – в нативном виде. Если спороносную культуру не удастся выделить из первой порции, придется выделять ее из смешанной культуры, выросшей в результате засева нативного патологического материала.
Б. Цель первого этапа – получение изолированного роста, т.е. собственно чистой культуры.
1. С этого этапа начинается культуральный метод диагностики при выделении аэробных и факультативно-анаэробных бактерий (за исключением бацилл).
а. Прежде всего патологический материал микроскопируется. Микроскопия патологического материала и в данном случае имеет только ориентировочное значение.
б. Затем патологический материал засевается на плотную питательную среду с таким расчетом, чтобы получить рост в виде отдельных колоний (так называемый изолированный рост). Сделать это можно или засевая материал бактериологической петлей штрихом или бактериологическим шпателем по Дригальскому.
1. При засеве штрихом поверхность питательного агара в чашке Петри мысленно делиться на четыре сектора. Сначала несколькими параллельными штрихами, каждый раз отрывая петлю от поверхности среды, засевается первый сектор (Рис. 9-1). Затем петля стерилизуется в пламени горелки и материал первого сектора распределяется по поверхности второго сектора такими же несколькими штрихами, после каждого из которых петлю следует отрывать от поверхности питательной среды (Рис. 9-2). Подобным образом засеваются третий и четвертый сектора (Рис. 9-3 и 9-4), в результате чего после инкубирования в термостате мы получаем изолированный рост, т.е. рост в виде отдельных изолированный друг от друга колоний в первом, втором, третьем или, в крайнем случае, четвертом секторе – в зависимости от концентрации бактериальных клеток в посевном материале (Рис. 9-5).
Рис. 9-1. Засев штрихом для получения изолированного роста: засев первого сектора |
Рис. 9-2. Засев штрихом для получения изолированного роста: засев второго сектора |
Рис. 9-3. Засев штрихом для получения изолированного роста: засев третьего сектора |
Рис. 9-4. Засев штрихом для получения изолированного роста: засев четвертого сектора |
Рис. 9-5. Засев штрихом для получения изолированного роста: результат засева (изолированный рост в третьем и четвертом секторах) |
|
2. При засеве по Дригальскому капля патологического материала распределяется бактериологическим шпателем по поверхности пластинчатого агара. Затем оставшийся на шпателе посевной материал распределяется по поверхности пластинчатого агара во второй чашке Петри, а затем таким же образом засевается третья чашка Петри. В зависимости от концентрации бактериальных клеток в посевном материале, изолированный рост будет или в первой или во второй или, в крайнем случае, в третьей чашке с пластинчатым агаром.
2. С этого же этапа начинается культуральный метод диагностики при выделении строгих и аэротолерантных анаэробных бактерий (за исключением клостридий).
а. Прежде всего патологический материал микроскопируется. Микроскопия патологического материала и в данном случае имеет только ориентировочное значение.
б. Затем патологический материал засевается на плотную питательную среду с таким расчетом, чтобы получить рост в виде отдельных колоний (так называемый изолированный рост). Сделать это можно или по методу Цейсслера или по методу Вейнберга.
1. Засев анаэробов по методу Цейсслера аналогичен изложенному выше методу засева шпателем по Дригальскому. Чашки после засева помещают в анаэростат или другое устройство, позволяющее культивировать бактерии в анаэробных условиях. Метод можно применять для выделения аэротолерантных бактерий, но он не подходит для выделения строгих анаэробов, так как в момент засева бактерии контактируют с атмосферным воздухом.
2. Засев по методу Вейнберга подходит для выделения как строгих, так и аэротолерантных бактерий. Заключается он в последовательном разведении посевного материала в ряде пробирок с расплавленной и остуженной агаризованной питательной средой с последующим быстрым ее охлаждением для глубинного культивирования (см. выше метод создания анаэробных условий культивирования «трубки Виньяль-Вийона»).
В. Цель второго этапа – накопление чистой культуры. Необходимость этого этапа обусловлена тем, что материала одной колонии – чистой культуры, полученной на предыдущем этапе – в подавляющем числе случаев недостаточно для ее окончательной идентификации.
1. При выделении аэробов и факультативных анаэробов на этом этапе изучают выросшие изолированные колонии и отбирают из них одну или несколько для последующей работы. Затем выбранную колонию мысленно делят на три части: из одной трети делают мазок, вторую используют для постановки реакции агглютинации, а оставшуюся засевают на новую питательную среду (чаще всего – на скошенный агар).
а. Изучение колонии играет очень важную роль, так как зачастую определяет успешность всей последующей работы по идентификации выделенной культуры; особенно в тех случаях, когда из патологического материала необходимо выделить конкретный вид.
1. Сначала колонию изучают в проходящем свете – сквозь дно чашки Петри и слой питательной среды (если степень прозрачности использованной питательной среды позволяет это сделать).
а. Определяют размер, т.е. диаметр колонии.
б. Оценивают форму ее очертаний.
в. Регистрируют степень прозрачности колонии.
2. Затем колонию изучают в отраженном свете – сквозь крышку чашки Петри или, слегка приоткрыв ее, чуть сбоку. Последний вариант с одной стороны более опасен и в отношении внутрилабораторного заражения проводящего исследование и в отношении контаминации выросшей культуры микроорганизмами воздуха лаборатории, но с другой – позволяет более адекватно оценить мельчайшие подробности внешнего вида колонии, а также уловить ее запах, что в ряде случае также несет информацию о природе выросшей культуры.
а. Определяют цвет колонии.
б. Описывают характер поверхности колонии.
в. Регистрируют положение колонии на питательной среде.
3.Заканчивают изучение колонии, просматривая ее краевую зону под микроскопом на малом увеличении.
а. Определяют характер края колонии.
б. Описывают структуру колонии.
б. Мазок из колонии необходим для выявления морфологических свойств выделяемой культуры. Как правило, мазок окрашивают по Граму.
в. Реакцию агглютинации на этом этапе проводят на стекле, суспензируя материал колонии в капле диагностической сыворотки. Если используется поливалентная сыворотка, то такую реакцию называют ориентировочной, так как определяется не конкретный серовар, а группа сероваров, к которой относится идентифицируемый вариант.
г. Наконец, оставшуюся часть колонии засевают густым штрихом на, например, скошенный агар с тем, чтобы получить большое количество бактериальной массы для проводимых на последнем этапе многочисленных методов идентификации.
2. При выделении строгих и аэротолерантных анаэробов на этом этапе также изучают выросшие изолированные колонии и отбирают из них одну или несколько для последующей работы. Затем выбранную колонию мысленно делят на три части: из одной трети делают мазок, вторую используют для постановки реакции агглютинации, а оставшуюся засевают на новую питательную среду.
а. Изучение колонии проводят аналогично изложенной выше процедуре для аэробных бактерий. Однако если колония получена в результате глубинного культивирования, то изучить ее в отраженном свете технически недоступно – в этих случаях не оценивают ни характер ее поверхности, ни положение ее на питательной среде.
б. Мазок из колонии так же, как в случае с аэробами окрашивают чаще всего по Граму.
в. Реакцию агглютинации проводят так же, как и при выделении аэробов. Однако если выделяют клостридии, то агглютинировать колонию нет необходимости, потому что серологические свойства бактериальной клетки для их идентификации не используются.
г. Для накопления чистой культуры анаэробов материал изолированной колонии засевают на среду Китта-Тароцци.
Г. Цель третьего этапа – окончательная идентификация чистой культуры.
1. При выделении облигатных аэробов и факультативных анаэробов изучают культуру, выросшую на скошенном агаре.
а. Прежде всего, накопленную культуру проверяют на чистоту путем микроскопирования приготовленного из нее мазка.
б. Затем проводят серологическую идентификацию культуры до серовара (если это необходимо), с помощью реакции агглютинации с моновалентными сыворотками.
в. Для изучения биохимических свойств культуру засевают на специальные питательные среды.
г. Определяют также вирулентность культуры (см. ниже раздел «Выявление и оценка вирулентности»).
д. И наконец, в случае необходимости, определяют эпидемиологические маркеры выделенной чистой культуры (такие, как фаготип, колицинотип и др.), включая антибиотикограмму (чувствительность выделенной культуры к антибиотикам).
2. При выделении строгих и аэротолерантных анаэробов изучают культуру, выросшую на среде Китта-Тароцци.
а. Прежде всего, как и при выделении аэробов, накопленную культуру проверяют на чистоту путем микроскопирования приготовленного из нее мазка.
б. Затем проводят серологическую идентификацию культуры до серовара (если это необходимо), с помощью реакции агглютинации с моновалентными сыворотками. В случае выделения клостридий серовар определяют по типу белкового токсина в реакции нейтрализации (этот метод разбирается в курсе иммунологии, а также – в применении именно к клостридиям – в курсе медицинской бактериологии).
в. Для изучения биохимических свойств культуру засевают на специальные питательные среды.
г. Определяют также вирулентность культуры (см. ниже раздел «Выявление и оценка вирулентности»). Особенно это важно в случае выделения клостридий, которые идентифицируются именно по одному из факторов вирулентности – белковому токсину.
д. И, наконец, при необходимости, определяют эпидемиологические маркеры выделенной чистой культуры, включая антибиотикограмму (чувствительность выделенной культуры к антибиотикам).
Д. Многие современные лаборатории оснащены приборами автоматической идентификации бактериальных культур, такими, как гемокультиватор BACTEC (Рис. 9-6 и 9-7), микробиологический анализатор PHOENIX (Рис. 9-8 и 9-9). В этом случае работа врача-бактериолога значительно облегчается, он освобождается от проведения многих однообразных и требующих больших временных затрат процедур, а его рабочее место больше напоминает рабочее место современного менеджера (Рис. 9-10 и 9-11). Однако и в этом случае принцип проведения культурального метода исследования полностью совпадает с изложенным в этом разделе, лишь второй и третий этапы осуществляются без участия человека – они практически полностью автоматизированы. Но при этом следует помнить, что компьютер может работать только с той информацией, которую в него «вложил» человек, поэтому если какой-либо вид микроорганизма по той или иной причине не внесен в программу автоматического анализатора, работа по его выделению и идентификации проводится по изложенному в этом разделе классическому алгоритму.
Рис. 9-6. Гемокультиватор BACTEC (клинико-диагностическая лаборатория Гродненской областной клинической больницы) |
Рис. 9-7. Гемокультиватор BACTEC в раскрытом виде (клинико-диагностическая лаборатория Гродненской областной клинической больницы) |
Рис. 9-8. Микробиологический анализатор PHOENIX (клинико-диагностическая лаборатория Гродненской областной клинической больницы) |
Рис. 9-9. Микробиологический анализатор PHOENIX в раскрытом виде (клинико-диагностическая лаборатория Гродненской областной клинической больницы) |
Рис. 9-10. Рабочее место бактериолога-преаналитика (клинико-диагностическая лаборатория Гродненской областной клинической больницы) |
Рис. 9-11. Рабочее место бактериолога (при регистрации результатов анализа) (клинико-диагностическая лаборатория Гродненской областной клинической больницы) |
