Розділ 3 антибіотик-асоційована діарея

Антибіотик-асоційована діарея – це три чи більше епізодів неоформлених випорожнень (протягом двох та більше днів), які з’явилися на фоні застосування антибіотиків чи протягом 8 тижнів після їх відміни.

По даним епідеміологічних досліджень симптоми ААД проявилися у 62% пацієнтів під час прийому антибіотиків, так і протягом 2-х місяців після лікування [25].

Неінфекційна або ідіопатична ААД є результатом впливу антибіотиків на моторну функцію травного тракту. Наприклад, препарати групи 14-ти членних макролідів стимулюють моторику травного тракту, через взаємодію з мотиліновими рецепторами. Послаблюючу дію мають парентеральні цефалоспорини, які виділяються з жовчю (цефаперазон і цефтріаксон) і пероральний цефалоспорин – цефиксим. Такий антибіотик як тетрациклін, викликає пряму токсичну дію на слизову оболонку кишечника [27].

Ще одним механізмом формування ААД є порушення складу нормальної флори кишечника, тобто поява резистентних штамів мікробів, відсутніх у нормі. Найбільш відомим представником таких мікроорганізмів є патогенний штам Clostridium difficile (C. difficile). Умовами розмноження C. difficile є анаеробне середовище та пригнічення нормальної мікрофлори кишечника [26]. По даним зарубіжних авторів, діарея, що зумовлена C. difficile, складає 30% всіх ААД та 50-75% антибіотик-асоційованих колітів [25].

Але причиною діареї, асоційованої з антибіотиками, можуть бути й інші мікроби, які здатні посилювати секрецію іонів та води і пошкоджувати стінку кишки. Це стафілококи, протей, дріжджові гриби, ентерококи, синьогнійна паличка, клебсієла. ААД найбільш часто викликають лінкоміцин, ампіцилін, кліндоміцин, бензилпеніцилін, цефалоспорини, тетрацикліни, еритроміцин [4]. Важливо відзначити, що більшість цефалоспоринів сприяють росту чисельності ентерококів і C. difficile [17].

Порушення метаболічної активності облігатної мікрофлори, а також кількісний її дефіцит супроводжується формуванням різних порушень травлення, в першу чергу – перетравлення вуглеводів, що зумовлює розвиток осмотичної діареї з втратою великої кількості рідини. Разом з цим знижується синтез нормальними мікробами шлунково-кишкового тракту КЛЖК, що призводить до зменшення абсорбції рідини електролітів колоноцитами [24].

ААД, яка розвивається після відміни антибіотикотерапії (приблизно через 8 тижнів), в більшості випадків має інфекційну природу, і напевно обумовлена колонізацією кишечника умовно патогенними штамами бактерій.

Можна виділити 2 можливі механізми аад:

1. Прямий - через регуляцію активності іон-селективних каналів, а саме цАмф-залежних хлор-селективних каналів cftr та аквапоринових каналів, що відповідають за транспорт води;

2. Опосередкований - через зміни в рівні КЛЖК та sIgA в результаті порушення складу мікрофлори товстої кишки [24].

Не дивлячись на величезну кількість клінічних описових даних щодо проявів ААД, механізми впливу антибіотиків на транспортну функцію епітелію товстої кишки досліджені недостатньо та в більшості випадків залишаються на рівні припущень та гіпотез.

Розділ 4 матеріали, обєкт і методи дослідження

Забір бактеріального матеріалу з зіва людини

Забір матеріалу з зіву проводили натще або не раніше ніж через 2-3 години після приймання їжі. Перед забором матеріалу досліджуваний учень добре полоскав ротову порожнину. Для забору матеріалу учень закидав голову назад, ватним тампоном протирали поверхню мигдалин, при цьому не торкалися язика, щік та зубів. Посів на дослідне середовище здійснювали миттєво.

Посів з зіва проведений на 3 учнях, які дали згоду взяти участь у експерименті.

Диско-дифузійний метод

Ч

Рис. 1 Диско-дифузійний метод

утливість до антимікробних препаратів вивчали диско-дифузійним методом. Метод оснований на здатності антибактеріальних препаратів дифундувати з просочених ними паперових дисків в поживне середовище і пригнічувати ріст мікроорганізмів посіяних на поверхні агару. На поверхню твердого стрептоміцетного середовища (Гаузе –2) в чашках Петрі наносили 1 мл бактеріальної суспензії (10⁹ КУО/мл), отриманої з зіва, та ретельно розтирали шпателем, після чого розміщували диски з антибіотиками. Посіви інкубували при 37° С протягом 24 год. Чутливість до антибіотиків виражали в мм діаметру зон затримки росту досліджуваних культур. Резистентними вважали штами, зони затримки росту яких складали 0-8 мм; чутливими – 9-18 мм; надчутливими – більше 18 мм.

Лабораторні тварини

Дослідження проведені на 12 білих не лінійних щурах самцях, масою 180-240 г. Тварин утримували в стандартних умовах віварію Навчально-наукового центру «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка: в приміщенні з контрольованою температурою повітря та циклом день-ніч (12:12 год). Тварини отримували стандартний корм для гризунів та водопровідну воду.

Роботу виконано у відповідності до Хельсінської декларації (Всесвітня медична асамблея, 1964), Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей (Страсбург, 1986), Декларації принципів толерантності (28 сесія ЮНЕСКО, 1995), Універсальної декларації по біоетиці та правах людини (ООН, 1997), норм Конвенції про захист прав людини у зв’язку з впровадженням нових біомедичних технологій, прийнятою у 1997 році у м. Ов’єдо (Іспанія) та підписаною Верховною Радою України у 2002 році, Закону України № 3447 ІV “Про захист тварин від жорстокого поводження”.

Схема експерименту на щурах

Перед початком експерименту щури були розподілені на 2 групи: 1 група (n=6) - контроль, 2 (n=6) група - дослід. Щурам дослідної групи впродовж 5 днів внутрішньом’язово вводили цефтріаксон (БХФЗ, Україна) в дозі 50 мг/кг маси у вигляді водної суспензії. Щурам контрольної групи впродовж 5 днів внутрішньом’язово вводили 0,2 мл дистильованої води.

Першим днем експерименту вважали день початку введення антибіотику. Перед введенням антибіотику, у щурів кожної групи (1, 2 групи) були зібрані фекалії для бактеріологічного посіву. Через день після останнього введення антибіотику (6-й день експерименту) у щурів 1-ї і 2-ї групи були зібрані фекалії на бактеріологічний посів (просвітна мікрофлора). Після цього щурів умертвляли шляхом цервікальної дислокації, робили розтин черевної порожнини, видаляли товсту кишку та брали 1 см (на відстані 2 см від анального отвору) для бактеріального посіву пристінкової мікрофлори.

Моніторинг клінічних параметрів стану щурів

Моніторинг клінічних параметрів стану щурів, які визначались за масою тіла, млявістю (0-3 бали: 0 - норма, 1 – помірно піднята шерсть, 2 – тварина брудна, зменшення спонтанних рухів, 3 – тварина майже не рухається, не реагує на інших тварин), діареєю (0-3 бали: 0 - норма; 1 - м’який чи водянистий стілець, волога пляма навколо ануса до 1 см²; 2 - волога пляма навколо ануса більше ніж 1 см², захватує нижню частину живота; 3 - пляма доходить до грудей), оцінювали щоденно.

Бактеріологічне визначення мікробіоценозу товстої кишки щурів

Зібрані фекалії масою 1 г чи ділянку товстої кишки площею 1 см² миттєво погружали в пробірки зі стерильним буферним фізіологічним розчином (рН 7,2 – 7,4). Далі, готували робоче розведення випорожнень 1:10 додаючи в пробірку 10 мл буферного фізіологічного розчину (рН 7, 2 – 7, 4), відбирали 1 мл рідини і додавали прогомогенізовані фекалії чи кишку до мітки на пробірці, ретельно розтираючи за допомогою скляної палички. Зразки калу чи ділянки товстої кишки відразу ж розводили послідовно в стерильному фізіологічному розчині (від 10 ^-1 до 10 ^{– 8} ). Висів проводили на відповідні поживні агаризовані середовища Бактеріологічною петлею роблять посів на тверді поживні середовища (Ендо, Плоскірєва , вісмут-сульфіт-агар ) для виділення патогенних ентеробактерій та 1-2 мл середовища накопичення - селенітовий бульйон. Для дослідження мікробіоценозу кишківника готували відповідні розведення. Переносили 0,1 мл зависі із пробірки з робочим розведенням (1:10) в 9,9 мл буферного фізіологічного розчину. Ресуспендувати завись 6-8 разів, перенесли 0,1 мл в наступну пробірку з 9,9 мл буферного фізрозчину. Таким чином готували розведення до 10^-7, кожен раз змінюючи піпетки. Висів на відповідні поживні середовища проводили за нижче вказаною схемою :

1. із розведення 10^-8 1,0 мл висівали на дно пробірки із регенерованим (35 – 40 хвилин ) і охолодженим до 50 ºС середовищем Блаурока;

2. із розведення 10^-7 0,1 мл висівали на середовище МРС і 1,0 мл на регенероване середовище Блаурока;

3. із розведення 10^-5 по 0,1мл висівали на середовища МРС, для лактобацил , Сімонса та 0,05 мл на 5 % кров'яний агар ;

4. із розведення 10^-3 по 0,1 мл висівали на середовищах Сабуро і ЖСА .

Режим інкубації: посіви на середовищах Ендо, 5 % кров'яному агарі, Сімонса інкубують протягом 18- 24 год при температурі 37 ºС.

Посіви на середовищі ЖСА інкубували протягом 48 год при 37 ºС з попереднім переглядом через 24 год. інкубації .

Посіви на середовищі Сабуро інкубували протягом 48 год. при 37 ºС та 3 доби при температурі 18 ºС.

Середовище МРС з посівали досліджуваних зразків інкубували в ексикаторі зі свічкою при температурі 37 ºС 48 год.

Посіви на середовищі Блаурока інкубували 48 год при температурі 37ºС . Для виявлення дисбактеріозу кишечнику проводили кількісний облік колоній, що виросли на 5 % кров'яному агарі, ЖСА, середовищах Ендо, Сабуро, Сімонса та МРС .

Кількісний склад усіх мікроорганізмів в 1,0 г фекалій визначали за формулою:

S= n×a×b , де

S – кількість мікроорганізмів 1,0 г фекалій;

n – кількість колоній, що виросли на чашці Петрі;

a – коефіцієнт посівної дози (при посіві 0,1 = 10 ; 1, 0 = 1 ; 0, 05 мл = 20 )

b – ступінь розведення матеріалу .

Через 18–24 год росту на чашці з 5 % кров'яним агаром відмічали тільки гемолітичні форми кишкової і кокової мікрофлори, підраховували їх відсоток від загальної кількості колоній, що виросли на цій чашці, також враховували гемолітичні види УПЕ. Всі види колоній відбирали для подальшої ідентифікації.

При паралельному посіві однакової кількості матеріалу на середовища Ендо і Сімонса через 18 – 24 години відмічали кілька варіантів результатів:

• на середовищі Сімонса - ріст відсутній, на середовищі Ендо – лактозопозитивні із металічним блиском колонії . Це означає, що у даному матеріалі УПЕ немає . Після підрахунку колоній і аглютинації їх із сироваткою ОКА, дослідження припиняли, оскільки такий варіант характерний тільки для присутності кишкової палички;

• на середовищі Сімонса – голубі колонії , колір середовища змінений ; на середовищі Ендо виявляли лактозопозитивні колонії . Це означає , що в матеріалі присутні УПЕ, у цьому разі із середовища Ендо відбирали на середовище Олькельницького і скошене середовище Сімонса всі типові колонії, попередньо підрахувавши їх . Із чашки з середовищем Сімонса відбирали типові колонії на середовище Олькельницького;

• на середовищі Сімонса ріст відсутній, на середовищі Ендо виявляли суміш лактозопозитивних і лактозонегативних колоній. У даному випадку підраховували усі типи колоній та ідентифікували лактозонегативні колонії.

На наступний день порівнювали результати ферментації середовища Олькельницького відколотими колоніями , що були зняті із середовищ Ендо і Сімонса, враховуючи при цьому реакцію на скошеному середовищі Сімонса. У випадку одноразового результату проводили дослідження на один біохімічний ряд для кінцевої ідентифікації. Якщо на середовищі Олькельницького варіант «лактоза–кислота, глюкоза –кислота –газ, сечовина–(-) , сірководень – ( - ) » , а росту на скошеному середовищі Сімонса немає, тоді після аглютинації культури із сироваткою ОКА дослідження припиняли, оскільки такий варіант характерний тільки для кишкової палички.

Культивували мікроорганізми в аеробних та мікроаеробних умовах. Ідентифікацію ентеробактерій та стафілококів проводили за допомогою пластин для біохімічної ідентифікації (ПБДЕ та ПБДС виробництва Нижній Новгород, Росія). Видову ідентифікацію проводили загальноприйнятими методами, використовуючи номенклатуру Берги та відомості узагальнені в керівництвах по клінічній мікробіології [14 ].

Питомий вміст мікроорганізмів виражали кількістю останніх в 1 г калу з розрахунком для кожної групи мікроорганізмів lg (M±m).

Порушення колонізації кишечника оцінювали за методичними рекомендаціями, які були розроблені Інститутом післядипломної освіти ім. Шупика [14].

Статистична обробка результатів

Статистичну обробку результатів проводили за t-тестом Стьюдента для вибірок з нормальним розподілом Дані представлені у вигляді М±SD, n – кількість тварин у групі. Статистично значущою для всіх показників вважали різницю Р<0,05.

РОЗДІЛ 5