Протокол метода

1. Зарегистрировать перечень реакций по каждому анализу в рабочий журнал, включая положительный и отрицательный контроль. Промаркировать микропробирки.

2. Внести 25 мкл суспензии мононуклеаров (3х106/мл) в конические микропробирки.

3. Добавить 10 мкл раствора инактивированной кроличьей сыворотки, ресуспендировать клеточную взвесь.

4. Инкубировать при 18 – 20оС в течение 20 мин.

5. Внести специфические антитела в рабочей концентрации, ресуспендировать клеточную взвесь.

6. Инкубировать при 4оС в течение 30 мин.

7. Отмыть в ЗФФР 1 раз (центрифугировать при 400 g в течение 5 мин).

8. Добавить 10 мкл раствора инактивированной кроличьей сыворотки, ресуспендировать клеточную взвесь.

9. Инкубировать при 4оС в течение 5 мин.

10. Подготовить предметное стекло с парафилмом ex tempore:

    1. внести 20 мкл поли-L-лизин в лунки из парафилма

    2. инкубировать стекло при 37оС в течение 30 мин

    3. удалить остатки поли-L-лизина и поместить стекло в стаканчик с ЗФФР до использования (не допускать высыхания).

11. Внести 20 мкл флюороохромированных антител, ресуспендировать клеточную взвесь.

12. Инкубировать при 4оС в течение 30 мин.

13. Отмыть в ЗФФР 2 раза (центрифугировать при 400 g по 5 мин).

14. Внести 20 мкл 30% глицерина, тщательно перемешать клеточную взвесь с глицерином.

15. Перенести клетки во влажные лунки предметного стекла.

16. Инкубировать клетки на стекле во влажной камере при 4оС не менее 30 мин.

17. Хранить препараты во влажной камере при 4оС. Допускается хранение препаратов до 6 дней.

Оценка результатов

1. Считать не менее 200 клеток, сопоставляя фазовоконтрастную (световую) и флюоресцентную картину каждого поля зрения, определяя количество клеток, содержащих специфическую флюоресцентную метку:

Следует соблюдать следующий порядок в оценке результатов:

1. Просмотреть и подсчитать клетки в отрицательном и положительном контроле. В положительном контроле все клетки должны экспрессировать общелейкоцитарный маркер CD45. В отрицательном контроле (IgG1 мыши) положительных клеток не должно быть. В случае обнаружения положительных клеток в отрицательном контроле необходимо устранить неспецифическое связывание (Табл.1 в Приложении).

2. При световой микроскопии подсчитать 200 мононуклеаров и среди них, при флюоресцентной микроскопии, определить количество клеток, экспрессирующих моноцитарный маркер (CD14+ клетки).

3. При световой микроскопии подсчитать 200 мононуклеаров и среди них, при флюоресцентной микроскопии, определить количество клеток экспрессирующих антигены МНС класса II (HLA DR+ клетки).

4. При световой микроскопии подсчитать 200 лимфоцитов и среди них, при флюоресцентной микроскопии,* определить количество клеток, экспрессирующих В-клеточные антигены (например, CD19, CD20, CD22).

5. При световой микроскопии подсчитать 200 лимфоцитов и среди них, при флюоресцентной микроскопии, определить количество клеток, экспрессирующих Т-клеточные антигены (например, CD7, CD3, CD4, CD8).

6. При световой микроскопии подсчитать 200 лимфоцитов и среди них, при флюоресцентной микроскопии, определить количество клеток, экспрессирующих маркеры активации (например, CD25, CD38, CD71).

7. При световой микроскопии подсчитать 200 мононуклеаров и среди них, при флюоресцентной микроскопии, определить количество клеток экспрессирующих дополнительные молекулы (например, CD28, CD40, СD54, CD80, CD86, CD95 и т.п.).

8. Записать результаты в рабочий журнал.

 

*- здесь и далее при указании на подсчет в световом поле лимфоцитов, моноциты в счет не включать.

 

Выделение мононуклеарной фракции крови и костного мозга по методу Boyum (Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow //Scand.J.Clin.Lab.Investig.-1968.-Vol.21-Suppl.97.p.1-9)

Принцип метода

Принцип метода основан на различии в плавучей плотности форменных элементов крови. Смесь полисахарида фиколла и рентгеноконтрастного вещества изопак или верографин создает градиент с такой плотностью, которая позволяет при центрифугировании разделить клетки периферической крови и костного мозга на мононуклеарную фракцию (МФ), в которую входят лимфоциты, субпопуляция моноцитов и бластные гемопоэтические клетки, и фракцию, содержащую гранулоциты и эритроциты. МФ обладают меньшей, чем градиент, плотностью и располагаются над градиентом. Плотность гранулоцитов и эритроцитов больше, чем плотность градиента, они проходят через градиент, опускаясь на дно пробирки.

Методика МФ выделяют из гепаринизированной крови или костного мозга (7-10 МЕ гепарина/мл для крови и 20 МЕ гепарина/мл для костного мозга). Костный мозг разводят физиологическим раствором (рН 7,2) в соотношении 1:5; кровь, в соотношении 1:2 или 1:3. Разведенную физиологическим раствором кровь или костный мозг центрифугируют в градиенте плотности фиколл-верографин (Pharma cia Fine Chemicals, Швеция), плотность 1,077 г/мл (Хейфиц Л.Б., Абалкин В.А. Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности верографин-фиколл //Лаб.дело, 1973.-10.-с.579-581) при 400g в течение 30 мин. Полученную МФ трижды отмывают в ЗФФР (физиологический раствор, забуференный с помощью фосфатно-солевого буфера) и ресуспендируют в среде RPMI-1640 (Flow Laboratories, Англия) в концентрации 106 клеток в мл. Жизнеспособность клеток, определяемая по методу окрашивания с трипановым синим (Ланг Н.Р. Стимуляция лимфоцитов //М.:Медицина, 1976.-288 с.) превышает 96%.