3. Промывка

1. ЦЕЛЬ ПРОМЫВКИ – освободить исследуемый материал от излишнего количества фиксатора.

2. УСЛОВИЯ И ВРЕМЯ ПРОМЫВКИ – промывается в проточной воде 24-48 ч. Для промывки можно использовать стеклянную банку, обвязанную марлей, через отверстие в которой до дна сосуда пропущен резиновый шланг. Так же, для промывки гистологического материала, можно использовать колбу в пробку которой вставлены стеклянная воронка и отводящая трубка. Воду из крана пускают в воронку, а отток воды происходит через отводящую трубку. Мелкие объекты промывают в стеклянных трубках, обвязанных марлей, помещенных в открытую банку, куда поступает водопроводная вода.

4. Заливка

1. ЦЕЛЬ – получение тонких, равномерных срезов с исследуемого объекта.

2. ТЕХНИКА ЗАЛИВКИ – материал замораживают после фиксации и промывки от фиксатора.

5. Получение срезов на микротоме

1. МАРКА МИКРОТОМА, НОЖ, ОСОБЕННОСТИ РЕЗКИ – микротом замораживающий, нож «С», срезы собирают в воду или 30⁰ спирт.

2. ПОДГОТОВКА ПРЕДМЕТНЫХ СТЁКОЛ (МЫТЬЁ И ОБЕЗВОЖИВАНИЕ). Мытьё производят сначала в щелочном растворе, затем в проточной воде, далее в дистиллированной воде, после предметные стёкла помещают в сушильный шкаф. После мытья предметные стёкла помещают в спирт – эфир для обезвоживания.

3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СМЕСИ БЕЛКА С ГЛИЦЕРИНОМ ДЛЯ НАТИРАНИЯ ПРЕДМЕТНЫХ СТЁКОЛ. Свежий яичный белок взбивают шпателем и фильтруют через смоченный дистиллированной водой бумажный фильтр. К профильтрованному белку добавляют равный объём глицерина, смешивают и кладут для предупреждения загнивания 2-3 кусочка тимола величиной с зёрнышко пшеницы. В закрытой склянке белок с глицерином хранится длительное время.

4. РАЗМЕЩЕНИЕ ЗАМОРОЖЕННЫХ СРЕЗОВ НА ПРЕДМЕТНОМ СТЕКЛЕ. Смазать стекло смесью белка с глицерином. Для этого на середину предметного стекла наносят стеклянной палочкой небольшую каплю раствора белка с глицерином и кончиком обезжиренного (с помощью спирта) пальца растереть его тонким слоем.

Срез переносят на стекло смазанное смесью белка с глицерином и прижимают гладкой фильтровальной бумагой, смоченной 30⁰ спиртом.

6. Окрашивание срезов и заключение в оптически прозрачные среды

1. КРАСИТЕЛИ ГЕМАТОКСИЛИН – ЭОЗИН. Основные красители – представляют собой красящие основания или их соли. Структуры которые они окрашивают называются базофильные (ГЕМАТОКСИЛИН).

Кислые красители – представляют собой красящие кислоты и их соли. Структуры которые они окрашивают называются оксифильные (ацидофильные) (ЭОЗИН).

2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГЕМАТОКСИЛИНА. Для его приготовления 2 гр. Гематоксилина растворяют в 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3 гр. Калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингридиенты добавлять нужно в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет. Его используют при окрашивании срезов гематоксилин – эозином.

3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЭОЗИНА. Готовят 1% водный раствор Эозина.

4. РЕЗУЛЬТАТ ОКРАСКИ. Оксифильные структуры окрашиваются в розовый цвет красителем эозином, а базофильные структуры окрашиваются в синий цвет - гематоксилином. При окрашивание клетки - ядро фиолетовое, а цитоплазма розовая.

5. ОБРАБОТКА СРЕЗОВ ПОСЛЕ ОКРАШИВАНИЯ. Окрашенный препарат сначала обезвоживают, проводя по спиртам возрастающей концентрации 70⁰, 96⁰ карбол – ксилол, в котором он полностью обезвоживается и частично просветляется, затем просветляют в ксилоле.

Для приготовления карбол – ксилола кристаллический фенол расплавляют в термостате при температуре 56⁰С и смешивают с ксилолом в отношении 1:4. Карбоксил – ксилол разрушает некоторые красители, поэтому срезы в нём следует держать не более 2-3 минут, а затем тщательно промывать ксилолом.

6. ПРИГОТОВЛЕНИЕ БАЛЬЗАМА. Используют канадский бальзам разведённый в ксилоле. Кусочки канадского бальзама заливают ксилолом и ставят в термостат. Ксилол добавляют в таком количестве, чтобы бальзам получился жидким, и его можно было профильтровать. Затем бальзам оставляют в открытой склянке в вытяжном шкафу до тех пор, пока ксилол испариться настолько, что бальзам приобретёт консистенцию жидкого мёда. Если бальзам имеет кислую реакцию, что вредно отражается на препаратах, окрашенных некоторыми красителями. Для нейтрализации куски канадского бальзама разжижают путём нагревания и добавляют к нему немного порошка карбоната калия. Затем, помешивая, нагревают их в песочной бане до тех пор, пока капля, нанесённая на предметное стекло, не будет застывать в твёрдую, как стекло, массу (способ Колюччи).

7. ТЕХНИКА ЗАКЛЮЧЕНИЯ В ОПТИЧЕСКИ ПРОЗРАЧНЫЕ СРЕДЫ. При заключении ненаклеенных замороженных срезов после просветления в ксилоле их вылавливают на предметное стекло. При этом предметное стекло опускают в ксилол, подводят под срез, расправленный срез придерживают за верхний край препаровальной иглой и вытаскивают вместе со стеклом. Если срез вытащить из ксилола, а потом пытаться расправить его на стекле, он может быть безнадёжно измят. Обтирают с обратной стороны и по краям сухой чистой тряпочкой. На срез наносят каплю канадского бальзама и накрывают его покровным стеклом. Чтобы избежать попадания под покровное стекло пузырьков воздуха, необходимо соблюдать следующие правила: каплю бальзама наносят на край среза, затем покровное стекло ставят у края капли на предметное стекло под углом 45⁰, при этом бальзам растекается по краю покровного стекла. Свободный край покровного стекла придерживают препаровальной иглой и медленно опускают покровное стекло на срез. Бальзам при этом вытесняет воздух и растекается тонким слоем под покровным стеклом. Если бальзама было взято недостаточно и между стёклами остался воздух, можно нанести каплю бальзама у того края покровного стекла, где имеется воздух; бальзам затечёт под стекло. Заключённые препараты оставляют для просушивания в горизонтальном положении на лотках в течении 1-2 суток. После этого их можно поместить вертикально в специальные коробки для гистологических препаратов.