4. Применение ферментов в фармацевтическом анализе

В фармации первостепенное значение имеет стандартизация и контроль ,тва лекарственных препаратов. В ряде случаев, применительно к лекар-ным веществам природного происхождения, используют стандартиза-основанную на биологической активности соответствующего вещества, .вязано с тем, что фармакологический эффект обусловлен именно био-меской активностью того или иного препарата и не обязательно пропор-энален его концентрации. Стандартизация и контроль качества фермен-I — лекарственных препаратов также оцениваются по их каталитической 1ЖГИВНОСТИ.

Кроме того, ферменты применяют в качестве аналитических реагентов 1ддя оценки фармакологических препаратов. Широкое применение получил •истод определения глюкозы в крови при помощи фермента глюкозооксидазы:

Количество поглощенного кислорода определяют при помощи кислород-|ш>го электрода, что обеспечивает высокую точность анализа. Для аналитиче-••'~'\ целей чаще всего используют иммобилизованные ферменты в виде так лваемых ферментных электродов. Они представляют собой комбинацию трохимических датчиков и иммобилизованных ферментов. При взаимо-

-твии фермента с анализируемым веществом продукт реакции изменяет .лительно-восстановительный потенциал, что является индикатором со-

-кания исследуемого вещества в среде. Одним из первых был сконструирован

- ментный электрод, чувствительный к глю-

е (рис. 7.1).

В процессе ферментативной реакции кис-:од удаляется из среды со скоростью, про-^циональной содержанию глюкозы. Для контроля содержания в ростовых сре-

пенициллина применяют пенициллиновый ;ктрод с использованием рН-датчика, по-^1того иммобилизованным ферментом пени-.ътазой, которая катализирует реакцию:

На основе иммобилизованных ферментов получают электроды много­кратного действия. Электродом, изготовленным с помощью растворимого фермента, можно провести около 50 измерений, а с помощью химически им­мобилизованного на нерастворимом носителе несколько сотен измерений.

Данные о характеристиках некоторых ферментных электродов представ­лены в табл. 7.1.

Определение оротовой кислоты можно проводить при помощи соответст­вующей дегидрогеназы оротовой кислоты. Фермент при помощи НДДН ката­лизирует восстановление оротовой кислоты и образования НАД. Кокарбокси-лаза в крови определяется при помощи пирофосфотазы из Азр. т§ег, расщеп­ляющей ее с образованием тиамина, по количеству которого и определяют концентрацию кофермента.

7.5. Применение ферментов в производственных процессах

Многие ферменты используют в пищевой промышленности. В кондитер­ском производстве применяется инвертаза дрожжей, превращающая сахарозу в глюкозу и фруктозу, предотвращая кристаллизацию сахарозы при высоких ее концентрациях.

Глюкозоизомераза, иммобилизованная на целлюлозном носителе, приме­няется для получения глюкозо-фруктозных сиропов с преимущественным со­держанием фруктозы. Крупномасштабным производством является получе­ние глюкозы из крахмала с использованием иммобилизованной амилоглюко-зидазы в проточных перемешиваемых реакторах.

Для просветления пива используют протеиназы, в частности папаин, им­мобилизованный на хитине. В пивоварении для замены солода используют амилазы. Эти ферменты находят свое применение также при производстве па­токи и растворимого крахмала. В хлебопечении амилазы на 30% ускоряют процесс созревания теста, улучшают качество хлеба, предотвращая процесс черствления.

При обработке молока ферменты используют в нескольких технологиче­ских процессах.

При производстве сыра одной из основных стадий является коагуляция молока, которая осуществляется при помощи реннина. Для удешевления процесса в ряде случаев применяют бактериальные рен-нины, иммобилизованные на нерастворимых носителях. Вкусовые свойства сыра могут быть улучшены за счет укорочения цепи углеродных атомов в ре­зультате гидролиза под действием липаз микроорганизмов.

Отходом при производстве сыра является молочная сыворотка, содержа­щая большое количество лактозы. Последняя содержит галактозу и глюкозу, представляющую большую пищевую ценность. Однако получение глюкозы из лактозы при помощи растворимой лактазы нетехнологично, поэтому был раз­работан метод гидролиза лактозы при помощи иммобилизованной на триаце­тате целлюлозы лактазы.

Для стабилизации молока его обрабатывают протеиназами. Так, обрабо­танное иммобилизованным трипсином молоко меньше подвержено окислению и в течение двух недель не утрачивает своего вкуса.

Целлюлазы используют при приготовлении растворимого кофе, а также при обработке цитрусовых. Кислая липаза применяется в хлебопечении; она катализирует процесс образования моноглицеридов, препятствующих черств-лению хлеба.

В кожевенном производстве для обработки шкур применяют препараты протеиназ микробного происхождения, при этом качество сырья значительно улучшается, а время технологического процесса сокращается почти в два раза.

В текстильной промышленности лектолитические ферменты с успехом используют для переработки льносоломы и получения из нее льноволокна. Некоторые протеиназы применяют для обесклеивания шелка и высвобожде­ния шелковых волокон.

Широкое применение нашли ферменты в тонком органическом синтезе. Чаще всего используют гидролитические ферменты, иммобилизованные на растворимых носителях. В частности, гидролазы применяют для модифика­ции пенициллинов и цефалоспоринов. Биокаталитический процесс связан с модификацией боковой цепи антибиотика без изменения его ядра.

Примером может служить производство полусинтетических пеницилли­нов. Они являются производными 6-аминопенициллановой кислоты, деаци-лированной формы бензилпенициллина. В настоящее время известно много технологических процессов, в которых используется иммобилизованная пени-циллинамидаза, осуществляющая это деацилирование. Полусинтетические пенициллины получают в реакторах периодического действия, иммобилиза­цию фермента проводят на триацетате целлюлозы.

Некоторые биотехнологи предпочитают иммобилизованным ферментам иммобилизованные клетки. Действительно, выделение, очистка и иммобили­зация ферментов являются трудоемким и дорогостоящим процессом. Однако во многих случаях цель оправдывает средства, и иммобилизованные ферменты все больше находят применение в биотехнологии. Если клетки синтезируют ферменты, которые смогут повлиять на фермент или субстрат основной реак­ции, то применение иммобилизованных клеток нецелесообразно. И напротив, при отсутствии факторов, мешающих катализу основной реакции, иммобили­зация микробных клеток возможна и целесообразна.

3. Основные углеводы пищи – это крахмал и другие полисахариды, а также дисахариды – сахароза и лактоза.

Примеры эволюции гидролиза углеводов:

• прокариоты: целлюлоза глюкоза

• грибы: целлюлоза глюкоза

• др. позвоноч. вступают в симбиоз с прокариотами ЖКТ

• зайцеобразные: дополняют симбиоз копрофагией

• травоядные: удлинен. кишечник

• жвачные: многокамерный желудок, отрыжка и повторное жевание

Два основных класса транспортеров Glu T локализованы в плазматич. мембранах (по G. Bell):

- Na/Glu-котранспортер = симпортер

• Ген на 22-й хромосоме, а в полипепти-де – 664 АКО. Он экспрессируется лишь в особых реснитчатых клетках эпителия тонкой кишки и проксимального отдела канальцев почки.

•Сопрягает диффузию Na⁺ по градиенту концентрации с активным транспортом Glu, против него.

• Разная потребность клеток в Glu вызвала появление тканеспе-цифичных изоформ транслоказ

50 % сходства АКП, разные К_м и чувствительность к ингибиторам:

GluT.1 – Основ. (учредительный) транспорт Glu в бол-во кл., в т.ч. эритро- и эндотелиоциты

GluT.2 - Транспортер Glu из кл. печени, киш-ка, почки.

GluT.3

- Км < GluT.1. Отвечает за транспорт в кл. мозга.

GluT.4 - Транспорт в липо- и миоциты. Имеют инсулинзавис-мый резерв в перикарионе.

GluT.5 -

• Транспортер в клетки эпителиев, в т.ч. и кишечного.

Локализация полипептида GluТ1 в плазматических мембранах

Полипептид в 492 АКО. Организован в 25 сегментов. 13 – в водных средах цитозоля и внекл. жидкости. С ними чередуются 12 гидрофобных трансмембранных α

спиралей, в пяти из которых: №№ 3,5,7,8,11, снаружи – ги

дрофобные R, контактирую

щие с липидами, а внутри –

полярные R гидрофильной

поры.

№ 2

1. Чем различаются элементный состав Земли и биосферы? Охарактеризуйте понятия «органогены», «макроэлементы» и «микроэлементы», указав их свойства и роль в жизнедеятельности.

2. Определение понятия «мононуклеотиды», их строение, свойства, номенклатура и функции.(КОМОВ – 174)

3. Обзорная схема источников и путей расхода глюкозы в клетках.

1. Элементарный состав Земли: O, K, C, Si, Mg, Mn, Al (8,8%), H, S, F, Ti, N, Ca, Cl, Rb (0,02%), Na, P, Ba (0,02%)

Элементарный состав биосферы: 1-4 периоды

Органогены (C, N, H, O, P, S) –

20-1% , Σ в ор-мах:

99(кг-г), св-в: образ. ковал. св., ф-ции: атомы всех биомолекул.

Макроэл-ты (Na, K, Ca, Mg, Cl) –

1-0,001%, Σ в ор-мах:

~

1(гр-мг), св-ва: в водн. р-рах – ионы, ф-ции: физ-хим. конст. р-ров.

Микроэл-ты (Fe,Cu,Zn, Mn, Co) –

< 0,001%, Σ в ор-мах: следы (мг-мкг),

св-ва: координац. реже ковал. св., ф-ции: вспомогательные.

2. Мононуклеотиды - Трехчленная органическая гетеромолекула, включающая азотистое основание = В, пентозу и фосфат в соотношении 1:1:1; 1:1:2 или 1:1:3

При этом У сочетается только с рибозой, а Т – только с дезоксирибозой, тогда как А, Г и Ц – в обеих комбинациях

Мононуклеотиды РНК: аденазин–3- и 5-фосфаты (адениновые к-ты), гуанозин-3- и 5фосфаты (гуаниловые к-ты), цитидин-3- и 5-фосфаты (цитидиловые к-ты), уридин-3- и 5-фосфаты (уридиловые к-ты).

Мононуклеотиды ДНК: 2-дезоксиаденозин-3- и 5фосфаты (дезоксиадениловые к-ты); 2-дезоксигаунозин-3- и 5-фосфаты (дезоксигуаниловые к-ты); 2-дезоксицитидин-3- и 5-фосфаты (дезоксицитидиловые к-ты); 2-дезокситимидин-3- и 5-фосфаты (тимидиловые к-ты)

Свойства мононуклеотидов:

- β-N-гликозидная связь N₉ Pur или N₁ Pyr c C₁ пентоз, делает их плоскости взаимно перпендикулярными.

- Молекулы одновременно амфотерны и дифильны, т.к. гидрофобные В, через полярную, но неионизируюмую пентозу, соединены с одной из сильнейших - фосфорной кислотой (рК =2,7).

Пурины: аденин, гуанин; пиримидины: урацил, тимин, цитозин.

Функции нуклеотидов:

- Энергетическая (АТФ, ГТФ

)

- Каталитическая (АТФ, ГТФ, УТФ, ЦТФ, HSKoA, НАД, НАДФ, ФАД, ФМН

)

- Регуляторная (АТФ/АДФ,ГТФ/ГДФ, цАМФ, цГМФ

)

- Структурная (АТФ, ГДФ, ЦТФ, УТФ,дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ

)

3.

№ 3

1. Опишите важнейшие физико-химические свойства воды и объясните их связь с биологическими функциями клеток. Как определить ее содержание в биоматериале? ( Биология – 86); Комов - 10

2. Биосинтез и распад пиримидиновых и пуриновых мононуклеотидов. (ЭЛ-189,184), Комов-432

3. Образование линейных (первичных) структур РНК и ДНК с помощью 5’, 3’-фосфодиэфирных связей. Основные свойства полинуклеотидов. (Эл -193, 221) Комов( 177,184) Био(106,109)

1. Свыше 90% всей массы кл. прих-тся на долю воды, в кл. эмали зубов ~10%. В воде растворены многие биологич. в-ва, и, будучи раств-лем, вода опред. их св-ва (реакционноспособность). Если мол-лы или макромол-лы содержат заряженные группировки, то диполи воды образ. вокруг них гидратные об-чки – связанная вода. Слой воды вокруг белка - 1,5—2,0 нм, что влияет на его св-ва. В кристалле льда мол-лы воды образ. гексагональную стр-ру. Льдообразная вода поддерживает третич- стр-ру ряда макромол-л. Часть связанной воды локализована внутри надмолек-ных стр-р и тж. участвует в стабилизации конформации макромол-л. Вода идеальный раств-ль для биологич. стр-р. Моно- и полисахари-ды, спирты, альдегиды и кетоны – раств. в воде, но практи­ч. нераствор. в органич. раствор-лях; расщипл. на катионы и анионы ионы быстро вступ. в химич. р-ции. Это обусловлено высокой диэлектрической проницаемостью воды, состоящ. из ассоциирован. др. с др. диполей. Диэлектрич. постоянная для воды = 80, а для орга­нич.раствор-лей — в 3—4 раза меньше. Это означает, что силы взаим-вия в в-вах, растворенных в воде, во столько же раз меньше, чем в органич. раствор-лях. Вода в кл. и тк. выполняет тж. транспорт. ф-цию (бол-во химич. соед. может проникнуть ч/з наружн. клеточ. мембр. только в растрор. виде), участв. в образ-ии высш. стр-р биологич. макромол-л, явл. донором ē и протонов в энергетич. обмене; под действием нек-рых ферментов – вступает в р-ции гидролиза  обр. новые в-ва с новыми св-вами. Вода – терморегулятор; за счет хорошей теплопроводности и большой теплоемкости, при изменении Т окр. среды, внутри кл. Т остается неизменной или колеблется незначительно. Кл-ный метаболизм зависит от баланса свободной и связ. воды. Нарушение этого соотнош. приводит к тяжелым последствиям, вплоть до гибели кл.

2. Биосинтез пуриновых рибонуклеотидов

Биосинтез пуриновых нуклеотидов из простых предшественников у различ. видов жив. орг-мов протекает одинаково. Происхождение каждого атома пуринового гетероцикла установлено экспериментами с пользованием изотопов. Общий предшественник всех пуриновых нуклеотидов - инозин-5-монофосфат (ИМФ), содержащ. в кач-ве азотистого осн-ния гипоксантин. 1 стадия: фосфорибозилпирофосфат (ФРПФ)  фосфорибозиламин сборка пуринового кольца. В синтезе ИМФ тж. участв. тетрагидрофолат (восстановленная форма витамина В₉), коферментная ф-ция к-рого связана с переносом одноуглеродных ост-ков. Синтез состоит из 10 стадий. Из ИМФ в 2 стадии образ. адениновая (АМФ) и гуаниловая (ГМФ). Синтез АМФ и ГМФ. В синтезе АМФ: ИМФаденилосукцинатАМФ

Биосинтез ГМФ: ИМФксантидиловая к-таГМФ

Биосинтез пиримединовых оснований:

Аспаргиновая к-та  в-ва с циклич. стр-рой - оротовой к-ты

?

3.

№ 4

1. Охарактеризуйте принципы образования гисто-гематических барьеров и водных пространств многоклеточных организмов.

2. Методы изучения пространственных структур РНК и ДНК. Гибридизация нуклеиновых кислот и ее роль в геносистематике.

3. Принцип полимеризации глюкозы на примере резервного полисахарида животных – гликогена. Его свойства и тканеспецифичные механизмы биосинтеза и мобилизации.(Эл-68) Ком -234,278,249

1.

2.

3. Гликоген – это разветвленный полисахарид животных. Молек. масса 10²-10⁵ кДа.

Роль гликогена:

• в ЖКТ гликоген и крахмал расщ-ся -амелазами слюны и поджелуд. железы до Д-глюкозы

• резервный полисахарид, содерж-ся в жив. тк. (в печени и мышцах)

• гликоген печени поддержив. физиолог. конц. Глк в крови (м/у приемами пищи)

• мышечный гликоген дает Глк мышцам

Гликоген локализован в цитозоле кл. в форме гранул.

Биосинтез гликогена:

Начинается ч/з 1-2 часа после приема пищи, содержащ. углеводы (с затратой энергии АТФ). 4 стадии:

• фосфорилирование ГлкГлк-6-Ф (затрата 1 АТФ), катализ-ся в мышцах – гексокеназы, в печени глюкокеназой.

• изомеризация Глк-6-ФГлк-1-Ф, катализ-ся фосфоглюкомутазой

• Глк-1-Ф + УТФ + фермент гликозо-1-фосфатуридинтрансефразаУДФ-Глк

• УДФ-Глк + гликогенУДФ + гликоген, катализ-ся гликогенсинтазой, происход. удл. цепи

Моболизация гликогена: гликогенфосфорилаза – слож. фер-т, кофермент. к-рого явл. пиродоксальфосфат.

Гликоген + Н₃РО₄  гликоген (укороч.) + Глк-1-Ф (катализ-ся гликогенфосфорилазой)  Глк-6-Ф 9катализ-ся фосфоглюкомутазой).

№ 5

1. Назовите важнейшие минеральные компоненты организмов, указав их функции. Как оценить их общее содержание в биоматериале?

БИО-85

2. Структура и свойства нуклеопротеидов на примерах вирусов, рибосом, информосом и хроматина.

3. Представления о структуре, механизмах образования и функциях свободных и связанных олигоз. Роль ацетилмурамовой и нейраминовой кислот в образовании оболочек прокариот и гликокаликса животных.

1. Минеральные соли. Большая часть неорг. в-в кл. - солей, либо ионы, либо в тв. состоянии. К⁺, Ка⁺, Са²⁺, обеспечивают раздражимость. В тк. многокл. жив. Са входит в состав межкл. «цемента», обусловливающ.сцепление кл. м/у собой и упоря­дочен. их располож. в тк. От конц. солей внутри кл. зависят буферные св-ва кл.

Буферностью - способность кл. поддерж. слабощелоч. р-цию своего содержим. на посто­янном уровне. Внутри клетки буферность обеспечивается глав­ным образом анионами Н₂РО₄^-. Во внеклеточной жидкости и в крови роль буфера играют Н₂СО^- и НСО|^-. Анионы слабых кислот и слабые щелочи связывают ионы водорода (Н⁴") и гидроксил-ионы (ОН ), благодаря чему реакция внутри клет­ки практически не меняется.

Нерастворимые минеральные соли, например фосфорно­кислый кальций, входят в состав межклеточного вещества костной ткани, в раковины моллюсков, обеспечивая проч­ность этих образований.

2.

3.

№ 6

1. Определите понятие «буферный раствор» и опишите их общие свойства. Охарактеризуйте буферные системы клеток и организмов. .(Эл-19)

2. Организация и эволюция геномов и вспомогательных механизмов управления ими у вирусов, прокариот и эукариот. Идентичность ДНК в клетках многоклеточных организмов.

3. Пентозофосфатный путь превращений глюкозы, окислительная и изомеразная ветви цикла, их роль в фотосинтезе и реакциях анаболизма различных клеток. (Эл-149)

1. Буферный р-р – это р-р состоящий из слабых к-т и сопряженных с ними оснований.

Св-ва: нейтрализует кислые и щелочные продукты накапливающиеся в организме.

Буферные системы:

• бикарбонатная – это угольная к-та и двуугликислый Na

• фосфатная – одно- и двуосновный фосфорнокислый Na

• гемоглобиновая – востановленный гемоглобин и калийная соль гемоглобина

• буферная система белков плазмы

2. Геном – это совокупность всех молекул ДНК в кл.

3. Пентозомонофосфатный путь

Пентозный путь широко распространен в природе (животные, бактерии, растения). В орг-ме чел-ка актив-ть этого пути высока в кл. лактирующ. лочной железы, жиров. тк., зрелых эритроцитах; низкий ур-нь этого процесса выявлен в печени (5—10%), скелетн. и сердеч. мышцах мозге (10%), щитовидной железе (15%), легких (15%).

Функции пентозомонофосфатного пути:

• поставляет востановит. эквиваленты (НАДФН) для р-ций восстановл. в процессах анаболизма (синтез высш. жирн. к-т, холестерола и др).

• образование важных стр-ных предшественников для анаболич. процессов в кл., в том числе рибозо-5-фосфат — для биосинтеза нуклеотидов и нуклеин. к-т, эритрозо-4-фосфат — для биосинтеза 3 аминокислот: фенилаланина, тирозина, триптофана.

В аэробных условиях путь выполняет энергетич. ф-цию, благодаря действию ф-тов, вызывающ. взаимопревращ. НАДФН и НАДН.

В зеленых растениях метаболиты пентозного пути выполняют важную р-цию фиксации СО₂ в цикле фотосинтеза.

Реакции пентозомонофосфатного пути.

Окислительная фаза:

- Р-ция дегидрирования Глк-6-Ф при действии Глк-6-фосфатдегидрогеназы, коферментом к-рой явл. НАДФ⁺:

- гидролиз лактона, спонтанно либо с помощью фер-та 6-фосфоглюконолактоназы:

- окислительное декарбоксилирование 6-фосфоглюконата, катализ-емая фер-том 6-фосфоглюконатдегидрогеназой, НАДФ⁺-зависимой, активируемой ионами Мg²⁺  кетопентоза-рибулозо-5-фосфат. Стехиометрическое уравнение:

Глюкозо-6-фосфат + 2НАДФ⁺ + 2Н₂ОРибулозо-5-фосфат + 2НАДФН • Н⁺ + СО₂

Неокислительная фаз:

- Р-ция кето-альдольной изомеризации рибулозо-5-Ф при действии фер-та изомеразы, в  рибозо-5-Ф.

- Р-ция эпимеризации: обращение конфигурации рибулозо-5-Ф при 3-ем углероде при действии фер-та эпимеразы  ксилулозо-5-Ф. Если рибозо-5-Ф вовлекается в анаболич. процессы, пентозный путь на этом этапе может завершаться.

- Ксилулозо-5-Ф + рибозо-5-Ф  глицеральдегид-3-Ф + седогептулозо-7-Ф (катализ-ся трансферазой; тиаминпирофосфат (ТПФ), Mg²⁺)

- Трансальдолазная р-ция: глицеральдегид-3-Ф + седогептулозо-7-Ф  фруктозо-6-Ф + эритрозо-4-Ф

- Вторая транскетолазная р-ция: ксилулозо-5-Ф + эритрозо-4-Ф  фруктозо-6-Ф + глицеральдегид-3-Ф (катализ-ся трансферазой; тиаминпирофосфат (ТПФ), Mg²⁺).

Стехиометрическое уравнение:

3Глк-6-Ф + 6НАДФ⁺ ——> ЗСО₂ + 2Фруктозо-6-Ф + Глицеральдегид-3-Ф + 6НАДФН • Н⁺

Главным регуляторным фер­ментом пентозного пути является Глк-6-фосфатдегидрогеназа, катализи­рующая первую реакцию.

№ 7

1. Охарактеризуйте структуру, важнейшие свойства и биологические функции 4-х основных классов малых биогенных молекул (биомономеров).

2. Стехиометрия реакций биосинтеза ДНК с участием субстратов, как источника энергии, матрицы, ферментов и других белков ДНК-репликативного комплекса. Роль циклинов и циклинзависимых протеиназ в продвижении клеток по фазам жизненного цикла. Комов 450-451

3. Анаэробный гликолиз. Последовательность этапов, энергетический эффект субстратного фосфорилирования и механизмы контроля скорости процесса. Представления о механизмах, биологической роли и типах брожения. Комов 244, 252