- •2. Правила взятия пат материала.
- •3. Фиксация пат материала.
- •4.Общие правила фиксации материала
- •5. Фиксирующие жидкости
- •6) Правила пересылки пат материала
- •7) Подготовка патматериала к микротомированию.
- •8) Порядок заливки пат материала в парафин.
- •9)Микротомы и приемы получения срезов на них
- •10.Методы окраски срезов и заключение их под покровное стекло.
10.Методы окраски срезов и заключение их под покровное стекло.
Употребляемые в гистологической технике краски делятся на 4 группы:
1. Кислые (фоновые, протоплазматические) краски, например, эозин, фуксин кислый, пикриновая кислота, отсюда и термин оксифилия – любящий кислоту, так как некоторые тканевые элементы воспринимают или окрашиваются только кислыми красителями.
2. Основные (ядерные), например, гематоксилин.
3. Нейтральные, например, метиленблау, нейтраль-рот (нейтрофилия).
4. Специальные, например, судан III и др.
Процесс окраски заключается в обработке среза в красящих растворах, контрастных по цвету и различных по химическому характеру.
Эозин (кислая краска красного цвета) реагирует со щелочной протоплазмой (оксифилия).
Гематоксилин (краска с щелочной реакцией лилового цвета) реагирует с кислым ядром (базофилия).
Метахромазия – такое явление, когда краска окрашивает ткань в другой цвет, нежели она сама. Например, тионин, муцикармин и др. являются красками синего цвета, а слизь окрашивают в красный цвет.
Способы окраски
1. Гематоксилин-эозин – обязательная ориентировочная окраска.
2. Дополнительные методы окраски, например, на соединительную ткань, жир, гемосидерин, эластику и т.д.
Следует помнить, что на качество окраски влияют способ фиксации, а также предварительная и последующая обработка препарата.
Красящие растворы должны быть чистыми, для чего любой краситель необходимо перед употреблением отфильтровывать, а водный раствор готовить только на дистиллированной воде. Окрашивать лучше красками низкой концентрации в течение длительного времени. Лучше срезы перекрашивать, а затем доводить до требуемой окраски путем отмывания в соответствующей жидкости, что позволяет более отчетливо видеть определенные элементы тканей. Окраска должна вестись под контролем микроскопа.
Окраска срезов гематоксилин-эозином
А. Необходимые материалы
1. Гематоксилин. Эту краску получают из коры кампешевого дерева, красящим веществом является продукт его окисления – гематеин (С16Н12O6).
2. Существует много рецептов окисления гематоксилина: например, квасцовый гематоксилин (гемалаун) Майера, железный гематоксилин Вейгерта, гематоксилин Эрлиха и т.д.
Гемалаун Майера:гематоксилина – 1,0,квасцов калийных – 50,0,йодноватокислого калия – 0,2,воды дистиллированной – 1000,0.
Гематоксилин Вейгерта:
I. 1%-ный раствор гематоксилина в спирте.
II. Полуторахлористого железа – 4 см3,соляной кислоты – 1 см3,воды дистиллированной – 95 см3.
Оба раствора приготовляют отдельно, смешивают перед употреблением в равных объемах.
Примечания.
1. 50%-ный раствор водного хлорного железа FeCl3 • 6Н2О – желто-бурая масса
2. Соляная кислота – 1%-ный водный или спиртовой раствор.
3. Эозин (анилиновая краска) – 0,1-1%-ный водный или спиртовой раствор.
Б. Ход окраски
Гематоксилин → Вода водопровод. → 1% НСl 0,5-1 мин. →
3-5 мин 0,5-1 мин до появления
розового цвета
→ Вода водопровод. → Эозин → Вода дистиллированная
0,5-1 мин 3-5 мин 0,5-1 мин
В. Результаты окраски:
1) ядра лиловые, синие,
2) цитоплазма клеток – различные тона красного цвета.
Заключение срезов под покровное стекло в пихтовый бальзам
Пихтовый бальзам представляет собой очищенную смолу хвойных деревьев. Она применяется для заделки окрашенных срезов под покровное стекло, потому что коэффициент преломления света бальзама одинаков с коэффициентом преломления света стекла.
Смола не смешивается с водой, поэтому окрашенный срез проводят через спирт для обезвоживания, карбол – ксилол (1 : 3) для удаления спирта и просветления, ксилол как растворитель пихтового бальзама (рис. 11).
Схема заключения в бальзам
1. Спирт 1 мин → карбол-ксилол 1 мин → ксилол 1 мин.
2. Срез извлекают из ксилола на предметное стекло.
3. На срез наносится капля бальзама и покрывается покровным стеклом
Окраска срезов на соединительную ткань по Ван-Гизону
А. Материалы
1. Гематоксилин Вейгерта.
2. Пикрофуксиновая смесь Ван-Гизон*: пикриновой кислоты (насыщенный водный раствор) – 100,0, фуксина кислого (1% водный раствор) – 10,0
Примечание. * При комнатной температуре в 100 мл дистиллированной воды растворяется около 1,2 г пикриновой кислоты.
Б. Ход окраски
Гематоксилин → Вода → Смесь Ван-Гизон → Вода дистиллированная →
1-3 мин 1 мин 5-10 мин 1 мин
→ Спирт → Карбол – ксилол → Ксилол
1 мин 1 мин 1 мин
→ Заключение в бальзам.
В. Результаты окраски: коллагеновые волокна соединительной ткани красного цвета протоплазма клеток и эритроциты желтого цвета; ядра лилового или коричневого цвета.
Окраска замороженных срезов для выявления жира суданом III
А. Необходимые материалы
1. Судан III
Рецепт: спирта 70° – 100 см3
Судана III – 0,3 г.
Кипятят несколько минут на водяной бане, охлаждают, фильтруют.
2. Гематоксилин Майера и Вейгерта.
3. 1%-ный раствор соляной кислоты.
4. 50%-ный раствор глицерина для заключения срезов под покровное стекло.
Б. Ход окраски
Спирт 50° → Судан III → Спирт 50° → Вода → Гематоксилин →
1-2 мин 3-20 мин 0,5-1 мин ополоснуть 2-3 с
Вода → соляная кислота → Вода →
2-3 мин 2-3 мин 1-2 мин
→ Срезы заключают в глицерин под покровное стекло.
В. Результаты окраски: жир оранжево-красного цвета; ядра синие, лиловые; протоплазма бесцветная.
Очень хорошие результаты для выявления жира получают при окраске щелочным суданом по Герксгеймеру:
спирт абсолютный (или 96°) – 70 мл.
10%-ный раствор едкого натра – 20 мл,
дистиллированная вода – 10 мл.
судан III или IV – 0,25 – 1,6 г.
Кипятят в течение нескольких минут на водяной бане. Окраска 3-5 мин.
Гистохимическая реакция гемосидерина в тканях по Перлсу
А. Необходимые материалы
1.СмесьПерлса:
1%-ный раствор: желтой кровяной соли (железисто-синеродистого калия) – 2 г,
воды дистиллированной – 100,0 см3,
2%-ный раствор: соляной кислоты – 1 см3,
воды дистиллированной – 100 см3.
Оба раствора смешивают в пропорциях 1:1,5 перед употреблением.
2. Кармин Гренахера:
кармина – 1,0,
квасцов калийных – 5,0,
воды дисташшрованной – 100 см3.
Кипятят 20 мин, после охлаждения фильтруют.
Б. Ход окраски
Смесь Перлса → Вода → Кармин → Вода →
5-10мин 1 мин 5-10 мин 1 мин
→ Заключение среза в пихтовый бальзам (спирт, карбол-ксилол, ксилол)
Примечание. Работа производится стеклянными иглами.
Результаты окраски: гемосидерин сине-голубого цвета, ядра темно-красные, протоплазма розовая.