- •Содержание
- •Глава 1.Обзор литературы
- •Глава 2.Материалы и методы исследования
- •Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение
- •Введение
- •Глава 1. Обзор литературы
- •1.1.Разнообразие белков семейства кальпаинов
- •1.2 Кальпаин / кальпастатиновая протеолитическая система.
- •1.3 Биохимические механизмы нейродегенеративных заболеваний
- •Глава 2.Материалы и методы исследования
- •2.1 Реагенты и приборы
- •2.2 Моделирование нейродегенерации у лабораторных животных
- •2.3 Анализ биохимических показателей
- •2.3.1 Экстракция белков из тканей
- •2.3.2 Определение активности кальпаинов
- •2.3.3 Зимография с козеином
- •2.3.4 Электрофорез белков в полиакриламидном геле
- •2.3.5 Вестерн-блот анализ
- •2.3.6 Другие методы
- •Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение
- •3.1 Интактные животные.
- •3.2 Ложнооперированные животные.
- •3.3 Животные с экспериментальной нейродегенерацией.
- •3.4 Введение пептида Аβ – модель ба.
- •3.5 Введение глутамата – модель эксайтотоксичности.
- •3.6 Эстрогенная терапия индуцированной нд
- •Заключение
- •Список литературы
3.2 Ложнооперированные животные.
Оперативное вмешательство (интрацеребральная инъекция физиологического раствора и наркотизация животного) оказывают достоверное влияние на общую активность кальпаинов как в поврежденном инъекцией отделе мозга (С1-область правого гиппокампа), так и, в меньшей степени, в удаленных областях (контрлатеральном гиппокампе и коре больших полушарий). Мы наблюдали повышение общей активности кальпаинов в сравнении с интактными животными (на 28-33% в сериях I и II, на 56% в серии III), особенно выражен прирост активности μ-кальпаина, при этом увеличивается доля кальпаинов, ассоциированных с мембранными структурами (рис. 1, 2). Содержание кальпастатина при этом незначительно снижается (до 90% от исходного в среднем во всех сериях; табл.). Характерно, что отмеченные эффекты сохраняются в течение 14 сут после операции, при этом скорость восстановления мозга у молодых животных (12 мес.; серии I и II) выше, чем у старых (24 мес.; серия III). В известной мере, оперативное вмешательство моделирует острое травматическое повреждение мозга.
3.3 Животные с экспериментальной нейродегенерацией.
В наших исследованиях животным вводились химические вещества – Аβ1-40 и глутамат, способные индуцировать нейродегенеративные изменения и моделирующие соответствующие нейропатологии человека – болезнь Альцгеймера и широкий спектр нарушений, сопровождаемых эксайтотоксичностью (ишемию, травму мозга, БА и другие). Инъекция различных повреждающих агентов производилась в С1-область гиппокампа – отдел головного мозга, в котором, во-первых, отмечаются наиболее выраженные признаки нейродегенерации альцгеймеровского типа и, во-вторых, высокочувствительный к токсическому действию глутамата. При сопоставлении этих моделей следует учесть ряд существенных различий повреждающих агентов, используемых нами: глутамат – нейромедиатор, для нейтрализации которого в нервной ткани имеется хорошо развитая система переносчиков, а амилоидный пептид вводился в уже агрегированной форме, которая сама по себе является фактором нарушения конформации нормальных белков подопытного животного и «затравкой» для образования новых агрегатов. Таким образом, фактически мы сравниваем модели острой нейротоксичности, индуцирующей компенсаторные механизмы в ткани, и хронической токсичности, против которой эндогенные нейропротективные механизмы неэффективны.
Следует отметить, что у крыс, которым вводили амилоидный β-пептид, мы отмечали существенные признаки нейродегенерации, о которых судили по результатам гистоморфологии нервной ткани различных отделов головного мозга (коры, гиппокампа) и поведенческих тестов (данные не приводятся), а проявления глутаматиндуцированного повреждения оказались менее выражены. Несмотря на стертую морфологическую картину повреждения тканей ЦНС, изменения когнитивной функции животных при действии выбранной дозы эксайтотоксического агента (глутамата) присутствовали и оценивались как умеренные.
Выявлены изменения кальпаин / кальпастатиновой системы, индуцированные введением указанных нейротоксичных агентов. В целом, уровень общей активности кальпаинов коррелирует с интенсивностью гибели клеток в гиппокампе и смежных отделах мозга (коре больших полушарий) и со степенью когнитивных нарушений у крыс экспериментальных групп.