Биологические функции антител
1. Нейтрализация вирусов.
— Связываются с вирусами, предотвращая их проникновение в клетку и последующую репликацию.
— Вызывают агрегацию вирусов с последующим поглощением фагоцитирующими клетками.
— Взаимодействуют с клеточными рецепторами вирусов, ингибируя связывание вирусов с клеточной поверхностью.
— Блокируют межклеточное проникновение вирусов.
— Обладают ферментативными свойствами.
Антитела особенно эффективны в тех случаях, когда вирусу для достижения клеток-мишеней необходимо пройти через кровоток. Тогда эффективными могут быть даже относительно низкие концентрации антител в крови. Поэтому наиболее очевидный защитный эффект антител наблюдается при инфекциях с длительным инкубационным периодом, когда вирус, прежде чем достичь клеток-мишеней, должен пройти через кровоток, где может быть нейтрализован даже очень небольшим количеством специфических антител.
2. Нейтрализация токсинов. Циркулирующие в крови продукты бактериального происхождения и другие экзотоксины (например, фосфолипаза пчелиного яда) связываются направленными против них антителами. Антитело, присоединившись вблизи активного центра токсина, может блокировать его взаимодействие с субстратом. Даже связываясь с токсином на некотором расстоянии от его активного центра, антитела могут подавить токсичность в результате аллостерических конформационных изменений. В комплексе с антителами токсин теряет способность к диффузии в тканях и может стать объектом фагоцитоза.
3. Опсонизация бактерий. Опсонизация — связывание антител с антигенами поверхности бактерий. В результате опсонизации бактерии становятся объектом интенсивного поглощения фагоцитирующими клетками. Действие антител усиливается белками системы комплемента, которые также связываются с бактериальной поверхностью. (Белки системы комплемента могут и самостоятельно опсонизировать бактерии.) На фагоцитирующих клетках имеются рецепторы для Fc-участков иммуноглобулинов и рецепторы для белков комплемента.
4. Активация системы комплемента. Связываясь с поверхностью клеток, антитела классов IgM и IgG приобретают способность инициировать классический путь активации комплемента. Активация приводит к отложению белков системы комплемента на поверхности бактериальных клеток, образованию пор в мембране и гибели клеток с последующим привлечением к месту событий фагоцитов и поглощением клеток фагоцитами.
5. Антителозависимая клеточная цитотоксичность. Антитела, связавшиеся с чужеродными антигенами на поверхности клеток, приобретают способность взаимодействовать с Fc-рецепторами на мембране цитотоксических клеток (естественные киллеры, цитотоксические Т-лимфоциты). Примерами мембранных чужеродных антигенов могут служить вирусные белки, появляющиеся на поверхности вирусинфицированных клеток. В результате взаимодействия антигена с антителом и Fc-рецептором образуется мостик, сближающий клетку-мишень и цитотоксическую клетку. После сближения цитотоксическая клетка убивает клетку-мишень.
6. Защита от паразитов. Существуют паразиты, слишком крупные, чтобы их можно было уничтожить путем фагоцитоза, например гельминты. Выделяемые паразитом антигены могут взаимодействовать с IgE, связанными через соответствующий рецептор с тучными клетками. В результате такого взаимодействия тучные клетки выбрасывают медиаторы, привлекающие эозинофилы. Последние уничтожают или нейтрализуют гельминтов путем выброса во внеклеточное пространство специфических эффекторных молекул.
7. Иммунорегуляторная функция. Антиидиотипические антитела взаимодействуют с активными центрами других антител (идиотипами) и осуществляют регуляцию гуморального иммунного ответа, подавляя их активность.
8. Проникновение через плаценту. В эмбриональный период и первые несколько месяцев жизни, когда собственная иммунная система ребенка еще недостаточно развита, защиту от инфекций обеспечивают материнские антитела, проникающие через плаценту или поступающие с молозивом и всасывающиеся в кишечнике. Через плаценту в кровь плода поступают антитела класса IgG. Основные классы иммуноглобулинов грудного молока — это IgG и секреторный IgA. Они не всасываются в кишечнике, а остаются в нем, защищая слизистые оболочки. Эти антитела направлены к бактериальным и вирусным антигенам, часто попадающим в кишечник.
Поликлональные и моноклональные антитела. Сыворотку крови, содержащую антитела к какому-либо антигену, называют антисывороткой. Антисыворотка, как правило,поликлональна, поскольку содержит антитела, продуцируемые разными клонами плазматических клеток. Антисыворотку обычно получают путем иммунизации организма каким-либо антигеном. Поликлональная антисыворотка может быть моноспецифической, то есть содержащей антитела к разным эпитопам одного и того же антигена. Например, выпускают поликлональные моноспецифические антисыворотки против тяжелых цепей иммуноглобулинов М, G, А человека. Каждая такая антисыворотка содержит поликлональные антитела, направленные к различным эпитопам какой-либо цепи иммуноглобулинов.
Моноклональные антитела продуцируются одним клоном плазмоцитов. Разработан метод получения больших количеств моноклональных антител с помощью, так называемой гибридомной технологии, являющейся одной из составляющих клеточной инженерии. Гибридомы являются бессмертными клеточными клонами, продуцирующими антитела одной специфичности.
Моноклональные антитела идентичны по своему строению, то есть относятся к одному и тому же классу, изотипу, аллотипу, имеют одинаковые активные центры, обладают одной и той же специфичностью, взаимодействуют с одним и тем же эпитопом антигена с одинаковой аффинностью. Моноклональные антитела могут нарабатываться в неограниченных количествах и используются в качестве
Существует два типа перекрестной реактивности антител.
— Антитела, направленные против какого-либо антигена одного вида животных, могут реагировать с антигенами другого вида. Причиной такой перекрестной реактивности является консервативность гомологичных биологических структур, например, белков, сохраняющих свою аминокислотную последовательность неизменной в процессе эволюции. Так, известен высоко консервативный белок, называемый Thy-1 антигеном и характерный для клеток тимуса позвоночных. Моноклональные антитела, взаимодействующие с Thy-1 антигеном человека, реагируют с Thy-1 антигеном земноводных и пресмыкающихся.
— Антитела, взаимодействующие со стереохимически сходными эпитопами, имеющими разную природу. Так, стрептококки несут антигены, конформационно сходные с антигенами сердечных клапанов. В результате, у лиц, перенесших стрептококковую ангину, может развиться ревматизм сердца вследствие наработки в организме перекрестно реагирующих антител к собственным антигенам. Такие антитела называют также аутоантителами, то есть антителами, направленными против собственных антигенов. В здоровом организме аутоантитела обычно присутствуют в следовых количествах.
Наличие эффекта перекрестного реагирования создает определенные трудности в оценке диагностической специфичности.
Иммуноглобулины отличаются от других белков исключительным полиморфизмом. Полиморфизм проявляется в наличии разных изотопов, аллотипов иммуноглобулинов, а также в разнообразии активных центров антител (идиотипов), определяющих их специфичность по отношению к антигенным детерминантам.
Во всех клетках, кроме созревающих В-лимфоцитов, кодирующая легкие и тяжелые цепи ДНК находится в так называемой «зародышевой конфигурации». Такую конфигурацию называют также генами зародышевой линии, или гаметными генами.
Тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов кодируются набором кодирующих нуклеотидных последовательностей, названных генными сегментами и разделенных друг от друга некодирующими участками ДНК. Генные сегменты являются предшественниками функционально активных генов и представляют собой экзоны, перемежающие с интронами. В ходе В-клеточного созревания эти генные сегменты перестраиваются и особым образом соединяются вместе, давая функционально активные гены цепей иммуноглобулинов. У человека и мыши существует три группы генных сегментов, обеспечивающих синтез всего многообразия тяжелых цепей иммуноглобулинов: V (variable — вариабельный), D (diversity — обеспечивающий разнообразие) и J (joining — соединительный). Сегменты расположены последовательно группами от 5' к 3' концу. Аналогичным образом выглядит зародышевая конфигурация ДНК, кодирующей легкие цепи.
Весь путь созревания В-лимфоцита от незрелой клетки-предшественницы до антителосекретирующей плазматической клетки можно разделить на несколько этапов.
1. Соматическая рекомбинация — перестройка (реаранжировка) генных сегментов, кодирующих вариабельные домены цепей иммуноглобулинов. Это первый этап на пути к синтезу антител и ключевой момент формирования функциональных вариабельных областей легких и тяжелых цепей. Соматическая рекомбинация идет на ранних этапах созревания В-лимфоцитов в костном мозге с участием специализированных ферментов. В результате соматической рекомбинации объединяются генные сегменты, кодирующие вариабельные домены цепей иммуноглобулинов. Объединенные экзоны, кодирующие V-домен, остаются при этом разделены интроном с генными сегментами, кодирующими константные домены. Соматической рекомбинации в ходе созревания В-лимфоцитов сначала подвергаются генные сегменты тяжелой цепи, затем - генные сегменты легких цепей.
Дополнительным источником разнообразия формирующихся активных центров являются включение вставок между сегментами (так называемые P и N-вставки), вариации в соединении сегментов, приводящие к потере или появлению новых нуклеотидов и, соответственно, к сдвигу рамки считывания, комбинации V-доменов легких и тяжелых цепей при сборке полной молекулы иммуноглобулина и, наконец, соматические гипермутации, происходящие позднее в более зрелых В-клетках. В перестроенных генах гипервариабельные участки V-доменов иммуноглобулинов кодируются последовательностями, находящимися на границе между сегментами. Гипервариабельность этих участков связана с тем, что дополнительные механизмы формирования разнообразия затрагивают именно эти районы нуклеотидной последовательности.
Перестройка генов легких и тяжелых цепей происходит только в одной из двух гомологичных хромосом. Это обеспечивает аллельное исключение в отношении продуцируемых клеткой антител. В итоге одна В-клетка и ее потомство способны продуцировать только иммуноглобулины, имеющие идентичные активные центры.
2. Синтез цепей иммуноглобулинов. Образуется первичный транскрипт РНК, содержащий нуклеотидные последовательности, включающие некодирующие интроны и генные сегменты, кодирующие домены иммуноглобулинов. Первичный транскрипт процессируется с удалением всех участков нуклеотидной последовательности кроме тех, которые кодируют вариабельный и константные домены мю-цепи. Образовавшаяся матричная РНК транспортируется из ядра в цитоплазму, где происходит синтез мю-цепей на полирибосомах шероховатого эндоплазматического ретикулюма. Мю-цепи после синтеза заякореваются на мембране эндоплазматического ретикулюма и объединяются с суррогатным полипептидом, заменяющим им легкую цепь. Затем происходит перестройка гена легкой цепи. На этой стадии В-лимфоцит представляет собой пре-B клетку. Синтез легкой цепи приводит к появлению на мембране лимфоцита полноценного мембранного IgM и к переходу В-лимфоцита в стадию незрелой B-клетки. Созревание в зрелую наивную B-клетку сопровождается одновременным появлением на клетке мембранного IgM и IgD. Они имеют один и тот же активный центр, но разные константные домены, образующиеся за счет альтернативного сплайсинга матричной РНК. Обе формы мембранного иммуноглобулина входят в состав В-клеточных рецепторов. В-лимфоцит, экспрессирующий (несущий на мембране) B-клеточный рецептор, выходит из костного мозга и приобретает способность активироваться при встрече с антигеном, взаимодействующим с активным центром иммуноглобулина.
3. Дополнительные модификации. Зрелые наивные В-клетки мигрируют в лимфоузлы и другие лимфоидные органы, где в результате встречи с антигеном происходит их активация. Активация приводит к трем дополнительным событиям, затрагивающим перестроенные гены иммуноглобулинов и характер их экспрессии:
— Переключение изотипа. Путем альтернативного сплайсинга матричной РНК генные сегменты, кодирующие мю-цепи и дельта-цепи, удаляются. На их место перемещаются сегменты, кодирующие константные домены тяжелых цепей других изотипов. В результате взамен иммуноглобулинов классов М и D В-клетки начинают синтезировать иммуноглобулины класса G, А или Е. Такие иммуноглобулины имеют тот же активный центр (вариабельный домен), но принадлежат к другому изотипу. Каждый В-лимфоцит в этом случае синтезирует иммуноглобулины только одного изотипа. Переключение изотипов регулируется цитокинами.
— Образование растворимых иммуноглобулинов (антител). Активация В-лимфоцитов приводит к их превращению в плазматические клетки — конечный этап дифференцировки В-клеток. Плазматические клетки теряют способность продуцировать мембранную форму иммуноглобулинов, но начинают синтез растворимых иммуноглобулинов.
— Соматические гипермутации. Затрагивают только гипервариабельные участки, кодирующие V-домены. Происходят в зародышевых (терминальных) центрах лимфоузлов, где концентрируются активированные В-клетки. Скорость мутаций вариабельных участков в генах легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов на несколько порядков превышает нормальный темп мутаций. Одна мутация возникает в среднем за два клеточных деления. Клетки делятся каждые 6 часов. Механизм соматических гипермутаций остается неизвестным.
Иммунологические методы анализа построены на взаимодействии антиген-антитело. С помощью таких методов можно выявлять как антитела, так и антигены. Определение может быть качественным и количественным. Эта группа методов не требует большого количества материала для анализа (микроанализ). Объем анализируемого материала в наиболее совершенных методах составляет 0,1 мл, а чувствительность достигает десятых долей нанограмма на миллилитр.
1. Иммунопреципитация. Метод основан на поливалентности антител. За счет наличия нескольких активных центров в составе иммуноглобулинов они могут взаимодействовать с одинаковыми эпитопами на нескольких антигенах. В результате образуются видимые глазом и выпадающие в осадок агрегаты (преципитат). Если антиген содержит несколько эпитопов, то с ним связывается несколько антител, что увеличивает массу агрегата. Различают иммунопреципитацию в растворе (наименее чувствительная) и преципитацию в геле (позволяет определять антитела и антигены с более высокой чувствительностью.Таким способом можно определить наличие или отсутствие в пробе антигена или антител.
Радиальная иммунодиффузия. В этом случае подготавливается плоский гель, в котором один из компонентов системы антиген-антитело размещен равномерно по всей толще геля. Второй компонент, тестируемый в системе антиген-антитело, помещают в лунку в центре плоского геля. Последующая диффузия тестируемого компонента приводит к образованию кольца преципитации вокруг центральной лунки. Чем выше концентрация тестируемого компонента, тем больше диаметр образующегося кольца. При использовании соответствующих калибровочных образцов, то есть набора проб с известной концентрацией, может быть проведено количественное определение компонента, наносимого в центральную лунку.
Иммуноэлектрофорез. Метод является качественным. С его помощью можно одновременно в одной пробе определить наличие множества антигенов, выявляемых антителами. Проводят электрофорез тестируемого образца в агарозном геле, затем по сторонам геля параллельно направлению миграции антигенов делают длинные лунки (траншеи), в которые заливают антисыворотку, содержащую антитела к тестируемым антигенам. При наличии в тестируемом образце искомых антигенов образуются дуги преципитации в тех зонах, куда мигрировали при электрофорезе антигены. Этим же методом можно определить наличие антител к конкретному антигену, находящемуся в смеси с другими антигенами.
Агглютинация (от лат. agglutinatio — склеивание). В основе метода лежит формирование видимых невооруженным глазом конгломератов клеток или частиц при образовании между ними молекулярных мостиков. В качестве мостиков могут выступать антитела и антигены. В основе феномена агглютинации лежит поливалентность антител, дающая возможность одному антителу связаться с несколькими клетками или частицами одновременно. Агглютинация может происходить между бактериальными клетками, между клетками крови, в частности эритроцитами, между латексными частицами. Бактериальные клетки несут поверхностные антигены. При добавлении к бактериальным клеткам антител против таких антигенов будет происходить их агглютинация. Определение групп крови с помощью соответствующих антисывороток также основано на феномене агглютинации. В этом случае образование конгломератов клеток с последующим их осаждением происходит в том случае, когда эритроциты несут на своей поверхности антигены (изоагглютинины), взаимодействующие с добавляемой к ним антисывороткой. При агглютинации эритроцитов метод называют гемагглютинацией.