14. Применение генетических методов в микробиологической диагностике

Современный период развития микробиологии характеризуется исследованием микроорганизмов на генетическом уровне. В связи с этим в современной медицине все большее распространение получают генетические методы микробиологической диагностики: определение процентного содержания гуанина и цитозина в бактериальном геноме, метод молекулярной гибридизации и особенно – полимеразная цепная реакция (ПЦР).

14.1. Метод молекулярной гибридизации

Этот метод используется для выявления степени сходства различных ДНК (при идентификации микроорганизмов проводят сравнение ДНК выделенного штамма с ДНК эталонного штамма).

А. Исследуемую ДНК нагревают в щелочной среде для расплетения ее на две отдельные нити.

Б. Одну из них закрепляют на специальном фильтре.

В. Этот фильтр помещают в раствор, содержащий радиоактивный зонд (одноцепочечную молекулу ДНК эталонного штамма, меченную радиоактивным изотопом).

Г. Затем температуру реакционной смеси понижают, чтобы создать условия для восстановления двухцепочечной структуры ДНК.

Д. В случае, если исследуемая ДНК и ДНК эталонного штамма относятся к одному виду – в реакционной смеси формируется двухцепочечная ДНК. При отрицательной реакции двухцепочечная ДНК не формируется (для оценки реакции используется биохимическая методика). На практике все связи двух цепочек полностью не восстанавливаются из-за высокого уровня генетической изменчивости микроорганизмов, поэтому реакцию оценивают по степени гомологии – проценту восстановленных связей между двумя цепочками ДНК.

14.2. Полимеразная цепная реакция

Этот метод относится к самым современным методам исследования, без которого не мыслима ни одна крупная микробиологическая лаборатория нашего времени.

А. ПЦР можно проводить для достижения трех целей.

1. Для обнаружения в патологическом материале конкретного вида микроорганизма без выделения чистой культуры.

2. Для идентификации выделенных чистых культур микроорганизмов.

3. Для генотипирования микроорганизмов, т.е. определения генетических вариантов одного вида.

Б. Принцип осуществления ПЦР заключается в увеличении (амплификации) количества искомого гена при положительной или отсутствии такого увеличения при отрицательной реакции (Рис. 14.2-1).

Рис. 14.2-1. Принцип положительной ПЦР: экстракция ДНК и, если в ней содержится искомый ген, ее количество в процессе реакции резко увеличивается, что выявляется с помощью электрофореза

1. Сначала из патологического материала или культуры микроорганизмов выделяется ДНК.

2. Затем путем нагрева в щелочной среде ДНК расплетается на две отдельные нити.

3. После этого в реакционную смесьдобавляют праймеры (участки ДНК, комплементарные 3’-концам искомого гена).

4. Реакционную смесь охлаждают.

5. Если в исследуемой ДНК имеется искомый ген, то праймеры создают фрагменты двухцепочечной ДНК, связываясь с комплементарными участками «своего» гена.

6. Затем в реакционную смесь добавляют нуклеотиды и ДНК-полимеразу.

7. Если в реакционной смеси наличествуют двухцепочечные фрагменты ДНК, то нуклеотиды присоединяются к 3’-концам праймеров, полностью достраивая соответствующий ген на всем его протяжении. А так как синтез начинался на каждой нити ДНК отдельно, то в результате получается две молекулы двухцепочечного ДНК. Другими словами, количество ДНК увеличивается в два раза.

8. Повторение циклов (от 30 до 80 раз) приводит к накоплению (амплификации) искомого гена (Рис. 14.2-2).

14.2-2. Принцип алгоритма проведения ПЦР

9. На завершающем этапе определяют количество ДНК в реакционной смеси с помощью электрофореза. При положительной реакции оно резко возрастает, в случае отрицательного результата – не изменяется. Полимеразная цепная реакция – сложная процедура, требующая квалифицированного персонала, комплекса оборудования и специальных расходных материалов. Для проведения реакции оборудуется специальное помещение, которое часто так и называется: лаборатория ПЦР (Рис. 14.2-3 – 14.2-11).

Рис. 14.2-4. Лаборатория ПЦР: выделение ДНК и ее амплификация	Рис. 14.2-5. Лаборатория ПЦР: рабочее место для проведения первых этапов реакции
Рис. 14.2-6. Лаборатория ПЦР: амплификатор	Рис. 14.2-7. Лаборатория ПЦР: рабочее место для проведения электрофореза
Рис. 14.2-8. Лаборатория ПЦР: свечение амплифицированного ДНК (определяемого электрофорезом) в ультрафиолетовом свете вследствие включения в его состав флуоресцентной метки	Рис. 14.2-9. Лаборатория ПЦР: трансиллюминатор (прибор для автоматической визуализации результата электрофореза – замена процедуры, приведенной на предыдущем рисунке)
Рис. 14.2-10. Лаборатория ПЦР: рабочее место для учета и оценки результатов	Рис. 14.2-11. Лаборатория ПЦР: расходные материалы