4. Проанализируйте возможность успешного сочетания биосинтеза, оргсинтеза и биотрансформации на примере получения беталактамных антибиотиков. Ответ

Биосинтез - это синтез природных органических соединений в живых организмах. Процессы биосинтеза играют важную роль во всех живых клетках. С точки зрения биотехнологии биосинтез рассматривается как промышленное получение биологически активных соединений (антибиотиков, гормонов, витаминов, аминокислот и т.д.) с участием живых организмов.

Антибиотики – низкомолекулярные (менее 2000 г/моль) вещества природного или полусинтетического происхождения. Оказывают подавляющее действие на рост и размножение бактерий и при этом относительно мало или вовсе не повреждающие клетки макроорганизма.

Продуцентами антибиотиков являются грибы, актиномицеты, бактерии. Антибиотики – вторичные метаболиты, органические соединения, не требующиеся культуре клеток для роста.

Биотехнологическое производство -лактамного антибиотика бензилпенициллина основано на промышленном культивировании плесневого гриба Penicillium chrysogenum. Ферментацию ведут в две стадии при температуре 22-26 ^оС, при рН среды от 5,0 до 7,5 при интенсивной аэрации среды. На второй стадии в среду добавляют фенилуксусную кислоту как предшественник бензилпенициллина. В течении 4 суток количество бензилпенициллина достигает максимума и ферментацию прекращают.

Бензилпенициллин (пенициллин G, от слова «gold») – «золотой» стандарт антибиотика. При ферментативном гидролизе бензилпенициллина образуется 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК), исходная структура, «core-structure» для синтеза новых антибиотиков. На основе 6-АПК было получено более 40000 полусинтетических пенициллинов. В промышленности 6-АПК получают путем гидролиза бензилпенициллина при участии штаммов бактерий с высоким содержанием пенициллиназы, или используют иммобилизованную пенициллиназу.

Примером успешного сочетания биосинтеза, оргсинтеза и биотрансформации может служить получение полусинтетического антибиотика ампициллина. Первая стадия - гидролиз бензилпенициллина и получение 6-АПК осуществляется при участии пенициллинацилазы мутанта Kluyvera citrophila. Далее в ферментер вносят мутант Pseudomonas melanogenum и метиловый эфир фенилглицина. Условия процесса изменяют таким образом, чтобы они способствовали образованию ампициллина. В роли катализатора выступает пенициллинацилаза, образуемая Pseudomonas melanogenum, которая не способна в этих условиях гидролизовать или синтезировать бензилпенициллин. В ходе этого двухстадийного процесса образуется только ампициллин (рис. 1, 2).

Рис. 1. Получение 6-АПК из бензилпенициллина

Рис. 2. Получение ампициллина из метилового эфира фенилглицина и 6-АПК

В качестве примера органического синтеза можно рассматривать химический синтез радикалов, которые используются для получения различных антибиотиков пенициллинового ряда из 6-АПК.

Биотрансформация – это методы генетической инженерии, которые позволяют получить высокопродуктивные биотехнологические штаммы. Традиционно это введение определенного гена в плазмиду, а затем получение генетически модифицированных продуцентов с полезными свойствами. К современным методам биотрансформации можно отнести error-prone PCR (использование не полностью подходящего праймера для получения точечных направленных мутаций в амплифицированном гене) и DNA shuffling (разрезание ДНК на фрагменты 50-100 п.н., а затем проведение ПЦР без праймера, так что эти фрагменты сами служат праймерами). Методы DNA shuffling и error-prone PCR позволяют получить гибриды или химерные формы организмов, обладающие уникальными свойствами.