Информационный материал.

Сложные методы окраски используют для выявления различных компонентов бактериальных клеток и для дифференциации бактерий в зависимости от химического состава и ультраструктуры. Для сложных методов окрашивания в отличии от простых используется не менее двух различных красителей, один из которых является основным а другой дополнительным.

В бактериальной клетке имеются облигатные органоиды, к которым относят клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму, нуклеоид, рибосомы, мезосомы и факультативные органоиды: капсула, жгутики, фимбрии, пили, споры, плазмиды, включения.

Нуклеоид бактерий представлен двунитчатой ДНК, замкнутой в кольцо и расположен в центре клетки. Основными отличительными чертами ядерной субстанции бактерий от эукариотических клеток являются:

1. Отсутствие ядерной оболочки

2. Отсутствие ядрышка

3. Отсутствие гистонов

Для обнаружения бактериального ядра необходимо применение электронной микроскопии или применение окраски по способу Фельгена или по Романовскому-Гимза.

Цитотоплазма бактерий состоит из растворимых белков. Рибосомы бактерий состоят из двух субъединиц и имеют коэффициент седиментации 70S. В циотоплазме некоторых бактерий имеются запасы питательных веществ в виде включений, которые можно обнаружить при помощи различных методов окрашивания. Например, в цитоплазме у С. diphtheriae присутствуют зерна волютина, они являются включениями фосфатов и имеют в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию. Для выявления зерен волютина применяют окраску по методу Нейссера.

Клеточная стенка бактерий придает им определенную форму, участвует в процессах обмена веществ и деления клетки.

У бактерий можно выявить присутствие клеточной стенки с помощью электронной микроскопии, при окрашивании по методу Грама, Циля-Нильсена.

Клеточная стенка грамположительных бактерий значительно толще, чем у грамотрицательных, в ней содержится значительное количество пептидогликана (40-90%) связанного с тейхоевыми кислотами. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана не превышает 10%.

Цитоплазматическая мембрана участвует в регуляции осмотического давления, в процессах обмена и транспорта веществ. Она окружает наружнюю часть цитоплазмы и состоит из двойного слоя липидов со встроенными поверхностными и интегральными белками. Цитоплазма способна образовывать особые впячивания, которые получили название мезосом. Мезосомы принимают участие в делении клетки, в процессе спорообразования, в синтезе некоторых веществ.

Капсула расположена снаружи клеточной стенки, представляет собой слизистое образование, состоящее из полисахаридов или полипептидов. Она имеет защитное значение, у патогенных бактерий капсула образуется чаще всего внутри организма человека или животного и препятствует фагоцитозу, повышает устойчивость к действию антител.

Некоторые бактерии (например, клебсиеллы, псевдомонады) образуют капсулу и в организме больного, и на питательной среде, где они дают крупные, слизистые колонии.

Капсула выявляется при специальных методах окраски.

Споры образуются при неблагоприятных условиях внешней среды (Вас. аnthracis, С. tetani). Спорообразование способствует сохранению вида и не является способом размножения. У клостридий спора превышает диаметр клетки, у бацилл – нет. Форма спор может быть овальной или округлой. У С. Tetani споры расположены терминально, для Вас. Аnthracis характерно центральное расположение спор. Споры химически инертны, поэтому окрашиваются с трудом. Для выявления этих структур используют окраску по методу Ожешки.

Жгутики имеются у подвижных бактерий. Они состоят из белка флагеллина. Оределение подвижности бактерий имеет диагностическое значение. По числу жгутиков и их расположению бактерии делятся на монотрихи, имеющие один жгутик, лофотрихи с пуч­ком жгутиков на одном конце клетки, амфитрихи имеют жгутики на обоих концах, и перитрихи, у которых жгутики расположены вокруг тела.

Жгутики можно обнаружить при электронной микроскопии после обработки тяжелыми металлами или в световом микроскопе после окраски по методу Леффлера, серебрения по Морозову.

Фимбрии и пили представляют собой нитевидные образования, расположенные на поверхности бактериальной клетки, состоящие из белка пилина. Существует несколько разновидностей фимбрий, которые отличаются друг от друга по выполняемым функциям: адгезия, питание, водно-солевой обмен. Пили участвуют в процессе конъюгации и образуются мужскими клетками-донорами.

Бактериоскопический метод диагностики основан на выявлении возбудителей инфекционных заболеваний в исследуемом материале по морфологическим, тинкториальным свойствам по взаимному расположению с применением различных методов окраски или в нативном состоянии.

Сфера применения: метод используется для диагностики заболеваний, возбудители которых обладают характерными морфологическим, тинкториальными, свойствами и типичной локализацией в организме, Например: гонорея, сифилис, возвратный тиф, туберкулез, некоторых микозы.

К достоинствам метода относятся быстрота, доступность, экономичность. К недостаткам метода относятся недостаточная информативность, низкая чувствительность, невозможность дифференциации внутри вида.

Методические указания:

Для выявления зерен волютина применяют окраску по методу Нейссера.

Окраска зерен волютина по методу Нейссера:

1. На фиксированный мазок нанести уксуснокислый метиленовый синий Нейссера на 2-3 мин.

2. Промыть водой.

3. Нанести дополнительный краситель - везувин.

4. Промыть водой, высушить.

При окраске образуется нерастворимый в воде комплекс: краситель-валютин. При промывке водой тело микробной клетки обесцвечивается, а гранулы валютина сохраняют синюю окраску. Тело клетки затем окрашивается везувином в желтый цвет.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:

1. На фиксированный мазок нанести нанести фильтровальную бумагу, пропитанную карболовым фуксином Циля и прогреть в течение 3-5 мин.

2. Промыть водой.

3. Нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 мин для обесцвечивания.

4. Промыть водой.

5. Докрасить мазок раствором метиленового синего 3-5 мин.

6. Промыть водой, высушить.

В основе метода лежат разрыхление клеточной стенки бактерий для усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под действием кислоты. Кислотоустойчивые бактерии отличаются высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии окрашиваются дополнительным красителем.

Окраска капсул по методу Бурри-Гинса:

1. Смешать каплю взвеси микробных клеток с каплей туши и при помощи стекла сделать мазок.

2. На мазок нанести водный раствор фуксина на 1-2 мин.

3. Промыть водой, высушить.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы не окрашиваются и остаются прозрачными на темном фоне туши.

Окраска спор по методу Ожешко:

1. Протравливание мазка 0,5 % раствором соляной кислоты 2-3 мин при нагревании.

2. Промыть водой.

3. Окрасить по методу Циля-Нильсена.

Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. В результате окрашивания споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.

Контрольные вопросы:

1. Какое строение и функции имеет нуклеоид бактериальной клетки?

2. Какое значение в жизни бактерий имеют плазмиды?

3. Каково строение спор бактерий?

4. Назовите последовательность операций при окраске микроорганизмов по методу Циля-Нильсена, Бурри, Ожешки, Нейссера.

5. С помощью какого метода окраски возможно обнаружить капсулы у бактерий?