Самостоятельная работа студентов

Работа № 1. Количественное определение белка сыворотки крови биуретовым методом.

Клинико-диагностическое значение. Сыворотка крови содержит смесь белков, различных по физиологическому значению, структуре и физико-химическому свойству. Нормальное содержание белка в сыворотке крови 65-80 г/л, у детей до 6 месяцев 48-56 г/л.

Изменение содержания белка в сыворотке крови может свидетельствовать о различных нарушениях. Снижение содержания белка (гипопротеинемия) может наблюдаться при потерях белка (кровотечения, болезни почек), при белковом голодании или при снижении процессов биосинтеза белка в результате различных заболеваний (интоксикации, злокачественных новообразований, хронических заболеваний). Повышенное содержание белка (гиперпротеинемия) бывает редко, это может быть при сгущении крови из-за значительной потери жидкости (длительная рвота, ожоговая болезнь, диарея), при наследственных заболеваниях - парапротеинемиях.

Одним из методов количественного определения суммарного белка сыворотки крови является биуретовый метод, который основан на способности белков, содержащих пептидные связи, образовывать с ионами меди в щелочной среде комплексные соединения фиолетового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию белка в растворе.

Техника выполнения работы. В пробирку налить 0,1 мл исследуемой сыворотки, в другую (контрольную) – 0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия. В обе пробирки добавить по 5,0 мл биуретового реактива (ионы Сu⁺⁺ в щелочной среде). Содержимое обеих пробирок перемешать. Через 30 мин. измерить экстинкцию исследуемого раствора на ФЭКе в кювете толщиной 1 см при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против контрольного раствора.

Содержание белка в сыворотке крови (в г/л) найти по калибровочному графику, который построен с заранее известными концентрациями стандартного белка и выражает зависимость между количеством белка в крови и оптической плотностью (экстинкцией) окрашенного раствора.

Построение калибровочного графика.

Для этого применяют стандартный белок – альбумин сыворотки крови. Из 10% стандартного раствора альбумина в 4 пробирках готовят растворы белка как показано в таблице.

№ пробирки	Стандартный 10% р-р альбумина, мл	0,9% раствор хлорида натрия, мл	Концентрация белка, г/л
1	0,4	0,6	40
2	0,6	0,4	60
3	0,8	0,2	80
4	1,0	–	100

Из каждой пробирки берут по 0,1 мл раствора, добавляют к нему 5,0 мл биуретового реактива. Через 30 мин. измеряют экстинкцию на ФЭКе против контрольного раствора (0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия и 5 мл биуретового реактива).

Полученные значения откладывают на оси ординат, а концентрацию белка (в г/л) на оси абсцисс.

Фотоэлектроколориметр

Для измерения оптической плотности или светопропускания жидких растворов по отношению к растворителю или стандартному раствору предназначен фотоэлектрический колориметр (ФЭК).

В основу работы этого прибора положен принцип уравнения интенсивности двух световых пучков, проходящих через оптические среды, при помощи переменной щелевой диафрагмы.

Световые лучи от лампы, отразившись от зеркал, проходят через светофильтры, кюветы и попадают на фотоэлементы, которые подключены к гальванометру. Так что при равенстве интенсивности падающих на фотоэлементы световых пучков стрелка гальванометра стоит на нуле.

При вращении барабана диафрагма, связанная с ним, меняет свою ширину и тем самым величину светового потока, падающего на фотоэлемент.

Фотометрически нейтральный клин служит для ослабления светового потока, падающего на фотоэлемент.

Способ измерения.

1.В пучок света помещают кюветы с контрольным раствором.

2.Вращением ручки круговых фотометрических клиньев устанавливают стрелку гальванометра на нуль.

3.Затем в пучок света вводится кювета с исследуемым раствором, при этом стрелка гальванометра отклоняется от нулевого положения. Снимается показание.

4.Прибор после окончания работы выключить. Осторожно промыть кюветы.

УИРС. Исследование некоторых особенностей аминокислотного состава яичного, соевого белков и желатина.

Для изучения аминокислотного состава белков можно использовать специфические качественные реакции, основанные на особенностях строения бокового радикала аминокислот. Проделайте качественные реакции, указанные в таблице, с растворами яичного, соевого белков и с желатином, получаемым путем экстракции растворимых фракций белка соединительной ткани – коллагена. На основании полученных результатов сделайте выводы об особенностях аминокислотного состава указанных белков. Обратите внимание, что определяемые аминокислоты являются незаменимыми и обуславливают пищевую ценность белка. Исключение - тирозин, который является заменимой аминокислотой только при наличии достаточных количеств фенилаланина (синтезируется in vivo путем гидроксилирования фенилаланина).

Качественная реакция	Идентифицируемая кислота	Принцип	Методика	Результат
				яичный белок	соевый белок	желатин
Ксантопротеиновая (реакция Мульдера)	фенилаланин, тирозин, триптофан	Нитрование бензольного кольца	К 5 кап. р-ра белка добавить 3 кап. концентр. HNO3. Нагреть до кипения (осторожно!) до появления желтой окраски. После охлаждения добавить по кап. 10%NaOH до перехода окраски в оранжевую.
Реакция Миллона	Фенольная группа тирозина	образование ртутной соли нитротирозина	К 5 кап. р-ра белка добавить 3 кап. раствора Милона (азотнокислые соли окиси и закиси ртути в HNO3). Осторожно нагреть не доводя до кипения до появления пурпурно-красной окраски.
Реакция Фоля	SH-группа цистеина	В результате щелочного гидролиза цистеина образуется Na2S, образующий при взаимодествии с ацетатом свинца черный осадок PbS	В пробирку налить 10 кап. ацетата свинца и добавить по каплям р-р NaOH до растворения образующегося в начале гидрата окиси свинца. К раствору добавить 5 кап. р-ра белка и прокипятить до выпадения черного осадка.
Реакция Адамкевича	триптофан	конденсация триптофанав кисл. среде с глиоксиловой кислотой с образованием продуктов конденсации красно-фиолетового цвета	К 5 кап. р-ра белка добавить 5 кап. конц. CH3COOH (источник глиоксиловой кислоты), слегка нагреть (!), затем охладить (!) и осторожно (!) по стенке наслоить 10 кап. конц.H2SO4. На границе 2-х слоев появляется красно-фиолетовое кольцо.

На основании полученных результатов сделайте вывод.