5.Методи дезинтеграции зараженных вирусом клеток.

Для характеристики вирусов в первую очередь важны их биохимические и биофизические свойства. Чтобы исследовать эти свойства, вирусы необходимо очистить.

Поскольку все известные вирусы - облигатные внутриклеточные паразиты, культивирование их производится либо в организмах интактных хозяев, либо а культуре клеток. Поэтому первой стадией получения вирусного препарата большинстве случаев является разрушение инфицированных клеток с целью высвобождения накопленного вируса.

Чтобы обеспечить полное освобождение вируса, эту операцию рекомендуется проводить даже в тех случаях, когда вирусная инфекция заканчивается лизисом большинства клеток. Разрушение клеток производят механическим способом (гомогенизацией, ультразвуковой дезинтеграцией, растиранием с кварцевым песком, продавливанием инфицированных клеток через пресс и т. д.). Эффективность разрушения растительных клеток можно повысить путем их предварительного замораживания, хотя в некоторых случаях это приводит к снижению выхода вируса.

Выбор экстрагирующего буферного раствора может оказать решающее влияние на эффективность очистки вируса. Для экстракции многих изометрических вирусов удобны кислые буферные растворы с рН около 5. дополнительное преимущество подобных растворов — осаждение многих клеточных белков при кислой реакции среды. Однако некоторые изометрические вирусы, например вирус мозаики огурцов и вирус кольцевой пятнистости табака, при рН около 5 выпадают в осадок, и поэтому для их выделения следует использовать растворы с рН, близким к нейтральному.

Наиболее распространенные дополнительные компоненты используемых растворов — это восстановители, препятствующие действию полифенолоксидаз растительных тканей (аскорбиновую кислоту, аскорбат натрия, сульфит натрия. Для подавления активности ферментов и диссоциации рибосом используют также хелатирующие агенты, чаще всего натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).

В результате разрушения зараженных клеток получают суспензию, содержащую клеточные компоненты и вирусные частицы, причем вирус, как правило, в суспензии оказывается сильно разбавленным. Таким образом, задача получения вирусного препарата сводится к очистке вируссодержащей суспензии от клеточных компонентов и к концентрированию Обычно эти две задачи решаются параллельно в несколько приемов с применением ряда методов.

6.Низкоскоростное центрифугирование как первуй этап очистки вірусів. Екстракція фітовірусів органічними розчинниками.

Первым этапом очистки вирусов является низкоскоростное центрифугирование (3-5 тыс. об./мин, 10-20 мин). Крупные частицы (неразрушенные клетки, ядра, фрагменты оболочки) при этом отделяются с осадком, а содержащая вирус надосадочная жидкость подвергается дальнейшей очистке. На этом этапе концентрирование вирусов не происходит, т.к. часть вируса адсорбируется на удаляемых частицах, поэтому осадок рекомендуется промывать и повторно центрифугировать. Для уменьшения процесса адсорбции низкоскоростное центрифугирование стараются проводить сразу после разрушения клеток.

При выделении вирусов растений производят экстракцию органическими растворителями, такими как хлороформ или смесь хлороформа с бутанолом (1:1), фреон и т.д. Суспензию вируса встряхивают с органическим растворителем 5-15 мин, прогревают при температуре 50-60⁰С, и денатурированные клеточные белки отделяют низкоскоростным ценрифугированием 10-15 тыс.об./мин, 15-20 мин.

На следующих стадиях очистки применяются разнообразные методы. Поскольку вирусные частицы имеют белковую (или липопротеиновую) оболочку, для их очистки и концентрирования можно использовать общие методы белковой химии, такие как осаждение в изоэлектрической точке и осаждение сульфатом аммония.