1.3. Екзогенний контроль
Припускають, що екзогенний контроль є стабільнішим в порівнянні з ендогенним контролем [19,20]. Екзогенний контроль можна використовувати для нормалізації даних ПЛР в реальному часі для тих тканин, процеси в яких відбуваються найбільш активно. Ефективність екзогенного контролю показана для дослідження регенерації печінки, де експресія різних генів відбувається особливо активно і значно змінюється. Екзогенний контроль додають в певній концентрації в трізол (розчин, що використовується для екстракції РНК, ДНК або білків), або в пробу безпосередньо перед проведенням реакції зворотної транскрипції. В першому випадку, РНК екзогенного контролю зазнає тих же змін при пробопідготовці, що і РНК гену інтересу [23].
Рис. 1.7. Етапи роботи при додаванні екзогенного контролю в трізол.
Основною вимогою до екзогенного контролю на відміну від ендогенного контролю є те, що його послідовність не має зустрічатися в організмі, який використовується в експерименті [24].
Отже, в процесі ПЛР реакції кількість досліджуваної нуклеїнової кислоти нормалізується за рівнем екзогенної нуклеїнової кислоти.
1.3.1. Ген люциферази
Люцифераза - загальний термін для класу окислювальних ферментів, що каталізують реакцію біолюмінесценції, що супроводжується випусканням світла.
Часто люцифераза застосовуються в генній інженерії: гени, що кодують цей фермент, вбудовують в одноклітинні організми і трансфекують в клітини.
В біологічних дослідженнях, гени, що кодують люциферазу використовуються, в основному, в якості репортерів. Вони дозволяють оцінити транскрипційну активність в трансфекованих клітинах. Також люцифераза може використовуватися для оцінки рівня АТФ в клітинах, що дозволяє перевіряти життєздатність клітини або активність її кіназ [25,26]. Оскільки навіть фемтомолярна кількість люциферази легко реєструються біолюмінесцентним методом, ген люциферази використовується як маркер при вивченні процесів транскрипції і трансляції генетичного матеріалу, а також при з'ясуванні ролі шаперонів в згортанні білків in vivo [27, 28].
1.4. Фолат-залежні процеси у плаценті людини.
Бар’єром між організмом матері та плодом виступає плацента, яка забезпечує постійний метаболічний зв'язок між двома організмами в період внутрішньоутробного розвитку. Нормальне функціонування плаценти визначає не тільки нормальний ріст і розвиток плода, а також здоров`я дитини у постнатальний період і до певної міри подальше здоров’я матері. Плацента виконує дихальну, травну, видільну, захисну, ендокринну функції. Імунні, гормональні та метаболічні процеси під час вагітності забезпечуються через судинну систему матері та плоду. Довгий час існувало уявлення, що плацента є транзитним органом для поживних речовин від матері до плоду та продуктів життєдіяльності плоду до матері. Однак плацента – орган, у якому відбуваються активні метаболічні процеси. 29. Через неї транспортуються незамінні амінокислоти, а деякі замінні синтезуються (наприклад, серин і гліцин). Гліцин є умовно незамінною амінокислотою для плода. Близько 90% гліцину плода утворюється з серину у плаценті. Гліцин активно використовується також у інших метаболічних процесах, включаючи пуриновий і порфіриновий синтез, синтез глутатіону разом з α-глутамілцистеїном та у перетворенні метіоніну. У печінці плода гліцин використовується для утворення серину, який потім потрапляє у плаценту, і човниковий механізм взаємодії плаценти та плода продовжує функціонувати 30.
Не дивлячись на те, що кров матері та плоду не змішується, оскільки їх роз’єднує плацентарний бар’єр, всі необхідні поживні речовини та кисень ембріон отримує через кров матері. Основний структурний компонент плаценти – війчасте дерево. Зріла плацента має вигляд дископодібної структури діаметром 15-20 см й товщиною 2,5 - 3,5 см. Її маса – 0,5-0,6 кг 31 (рис.1.8.).
Рис. 1.8. Схематичне зображення плаценти людини (за Faller et al, 2004).
У останні десятиріччя все більше уваги почали приділяти ролі плаценти у виникненні акушерської патології. Дефекти розвитку плаценти є потенційно летальними для плода. Численні прояви патологічного перебігу вагітності, зокрема плацентарна недостатність, спонтанні аборти, деякі патології вагітності та вади розвитку нервової трубки плода пов’язують з дефіцитом фолатів в раціоні вагітної жінки та поліморфізмом ферментів фолат-залежного метаболізму амінотіолів, а також з порушеннями обмінних процесів в плаценті. Фолати, як і численні інші метаболіти, потрапляють в плаценту з кров’ю матері і частково транспортуються до плода, а частково приймають участь у обмінних процесах у самій плаценті.
Як відомо, фолати є основними донорами одновуглецевих груп, які використовуються в синтезі попередників нуклеїнових кислот, метилуванні ДНК, метаболізмі амінокислот, синтезі S-аденозилметіоніну, що є донором метильних груп для метилтрансфераз. Основним показником порушеного фолат-залежного метаболізму амінотіолів вважається підвищений рівень гомоцистеїну (Hcy), який супроводжується гіпометилуванням ДНК, порушеннями проліферативних процесів, окисно-відновного стану клітин, тощо
[32,33]. Однак особливості фолат-залежних процесів у плаценті людини майже не досліджені і тому в наш час привертають увагу науковців.
Фолієва кислота є водорозчинним вітаміном групи В, відомим також як вітамін В9. Вона складається з птеридинового кільця, r-амінобензойної кислоти та глутамінової кислоти. Її хімічна назва ─ птероїлмоноглутамінова кислота (рис.1.7.).
Рис. 1.9. Формула птероїлгідрофолата
У тканинах ссавців фолати є донорами одновуглецевих фрагментів у численних біохімічних реакціях. Вони необхідні для біосинтезу тимідину і пуринів (аденозину і гуаніну), синтезу метіоніну (Met) шляхом метилування Hcy, задіяні у проміжному перетворенні серину і гліцину та метаболізмі гістидину і форміату. Через S-аденозилметіонін фолати є також непрямими донорами метильних груп у численних реакціях метилування. Оскільки еукаріоти не можуть синтезувати фолати de novo, то вони є незамінними поживними речовинами. Природні фолати найчастіше зустрічаються у вигляді тетрагідрофолатів (THF) з гідратованими 5-, 6-, 7- та 8- положеннями птеридинового кільця та у вигляді дигідрофолатів (DHF) з гідратованими 7- і 8- положеннями кільця. Спільна частина усіх фолатів, параамінобензойна кислота, приєднана до NH2- кінця птеридинового кільця, а один або більше залишків глутамінової кислоти приєднані до карбоксильного кінця. Одновуглецеві радикали, такі як метил, метилен, метеніл, форміл або форміміно, розміщені у N5 та N10 положенні. Одновуглецеві групи походять з β-вуглецю серину, гліцину, метил- і диметилгліцину, форміату і гістидину. Одновуглецеві групи, які походять з серину, транспортуються до THF у реакції, яка каталізується серин-гідроксиметилтрансферазою (SHMT, EC 2.1.2.1) з утворенням 5,10-метилентетрагідрофолату (5-methyleneTHF) і гліцину. Ця реакція набуває особливого значення у клітинах, що активно проліферують. Одновуглецева група 10-formylTHF походить з форміату за участі АТФ-залежного ензиму формілсинтетази (EC 6.3.4.3), яка активує форміат до 10-formylTHF. 10-formylTHF і 5,10-метинілтетрагідрофолат (5,10-methenylTHF) є субстратами для біосинтезу пуринів, у той час як 5,10-methyleneTHF залучений у біосинтез тимідину (рис.1.8 ) [34,35].
Рис.1.10.Схема фолатного метаболізму:
5-CH3THF ─ 5-метилтетрагідрофолат; 5,10-CH2THF─ 5,10-метилентетрагідрофолат;
DHF ─ дигідрофолат; THF ─ тетрагідрофолат; CHNHTHF ─ формімінотетрагідрофолат;
5,10-CHTHF ─ 5,10-метенілтетрагідрофолат; 10-CHOTHF ─ 10-формілтетрагідрофолат; SAM ─ S-аденозилметіонін; SAH ─ S-аденозилгомоцистеїн
Альтернативним джерелом одновуглецевих груп для THF є гістидин. Під час метаболізму гістидину формімінова група транспортується до THF, що супроводжується вивільненням аміаку і утворенням 5,10-methenylTHF. Ці реакції відбуваються за участі двох ферментів: глутаматформімінотрансферази (ЕС 2.1.2.5.) і формімінотетрагідрофолат циклодеамінази (EC 4.3.1.4). Цей шлях присутній лише у печінці і нирках [36]
Довгий час вважалося, що поліглутамінові похідні є лише формою вітаміну, яка акумулюються у організмі. Але зараз встановлено, що внутрішньоклітинне перетворення фолатів у поліглутамати важливе для нормального функціонування і регуляції фолатного метаболізму. Внутрішньоклітинний синтез поліглутаматів відбувається за участі ензима фолілполіглутамат синтетази (EC 6.3.2.17). Цей ензим присутній у більшості тканин ссавців. Він додає глютамінові залишки по одному до молекул фолату. Цей фермент формує пептидний зв`язок між γ-карбоксилом глутамату, який вже присутній у молекулі, і α-аміногрупою глутамату з використанням енергії АТФ [36]. У клітині фолати визначаються у цитозолі і мітохондріях. Ядра містять лише незначну кількість фолатів. Ензими, які локалізовані у цитозолі, беруть участь у біосинтезі пуринів, тимідилату і реакціях метилування. Перетворення серину і гліцину відбувається у обох компартментах клітини. У мітохондріях фолат-залежні ензими задіяні у синтезі тРНК і катаболізмі гліцину, саркозину і диметилгліцину [38].
Маркером фолат-залежного метаболізму амінотіолів є вміст гомоцистеїну (Hcy), який розташований у критичній точці метаболізму сірковмісних амінокислот. Він реметилюється з утворенням Met, шляхом транссульфування перетворюється на цистеїн (Cys) і взаємодіє з тРНК з утворенням гомоцистеїніл-тРНК з подальшим метилуванням та перетворенням її на метіонін-тРНК або на тіолактон Hcy. Баланс шляхів транссульфування і реметилування регулюється концентрацією Hcy і кінетичними властивостями ензимів цих шляхів [39]. Підвищений рівень Cys вважається токсичним через його потужну відновлювальну активність, здатність утворювати хелати з іонами металів та зв’язуватися із білками [40].
Глутатіон (g-Glu-CysH-Gly) (GSH) підтримує відновлений стан білків та тіолів, зберігає і транспортує Cys та захищає клітини від дії шкідливих речовин таких, як реактивні похідні кисню та ксенобіотики. Серед тіолів GSH є найважливішим компонентом окисно-відновної буферної системи. Відновлений GSH за участі глутатіонпероксидази взаємодіє з вільними радикалами, сам окислюється і таким чином підтримує редокс потенціал клітини і захищає її від оксидативного стресу.
За участі глутатіон-S-трансфераз (ГТ-ази) відбувається кон’югація глутатіону з токсичними речовинами, після чого глутатіонові кон’югати виводяться з організму [41].
Дефіцит надходження фолатів з їжею разом із носійством мутованих форм генів, що приймають участь у їх метаболізмі, призводить до порушення балансу між різними формами амінотіолів, виникнення окисного стресу в клітинах і має численні патологічні прояви, включаючи серцево-судинні захворювання, патології вагітності, дефекти розвитку плода та багато інших.