3.1. Зміни секреторної діяльності шлунка впродовж розвитку хронічного алкогольного панкреатиту у щурів

Дослідження впливу хронічного споживання етилового спирту на шлункову секрецію у часі проведені методом аспірації. Результати наших досліджень показали, що довготривале вживання алкоголю у щурів викликає зміни біохімічного складу шлункового соку.

Кислотність шлункового вмісту у щурів, які впродовж чотирьох тижнів споживали 20%-ий розчин етилового спирту, зростала і становила 2,9±0,34 ммоль/л, що на 74,7% (р<0,05) перевищувало такі значення у тварин, які вживали питну воду (1,66±0,33 ммоль/л). У наступні чотири тижні при споживанні алкоголю секреція соляної кислоти шлунковими залозами тварин посилювалась і була більшою, ніж після перших чотирьох тижнів алкоголізації. Концентрація соляної кислоти в аспіраті, відібраному через 8 тижнів хронічного вживання алкоголю, була найвищою щодо такої в інших зразках, отриманих після менше або більше тривалого споживання етилового спирту, і складала 4,23±0,45 ммоль/л, що було більшим, ніж у контролі на 154,82% (р<0,001) (Табл.1) .

Характер змін кислотності шлункового вмісту при подальшій алкоголізації був таким, як і через 4 та 8 тижнів. Проте, слід зазначити, що впродовж перших восьми тижнів споживання алкоголю концентрація соляної кислоти в шлунковому секреті поступово зростала, значно перевищуючи контрольні значення. При подальшому вживанні етанолу даний показник знижувався, проте залишався значно більшим, ніж у контролі. Так, через 12 тижнів хронічної алкоголізації кислотність шлункового вмісту перевищувала контрольні значення на 129,52% (р<0,001) і становила 3,81±0,37 ммоль/л (табл.1).

Важливе значення для оцінки функціонального стану шлунка має активність синтезу білків, які входять до складу шлункового соку. Результати наших досліджень показали, що під впливом етилового спирту, спожитого впродовж восьми тижнів, не відбувалось змін концентрації загального білка в секреті, проте через 12 тижнів вживання алкоголю індивідуальні коливання значень концентрації загального білка були дуже різкими. За цим показником отриманий у дослідах цифровий матеріал був розподілений на дві групи. Так, у 67% хронічно алкоголізованих тварин концентрація загального білка в секреті коливалась навколо контрольних значень і складала в середньому 26,8±4,76 мкг/мл, тоді як у 33% таких щурів вона суттєво збільшувалась і становила 111,25±9,83 мкг/мл, що було більшим, ніж у контролі на 391,39% (р<0,001) (Табл.1).

Таблиця 1

Концентрації складових шлункового соку голодних щурів впродовж розвитку експериментального хронічного алкогольного панкреатиту.

	Тривалість алкоголізації
	4 тижні	8 тижнів	12 тижнів 67%	12 тижнів 33%
Концентрація HCl ммоль/л	1,66 ±0,33	1,66±0,33	1,66±0,33	1,66±0,33
	2,9 ±0,34*	4,23±0,45***	3,81±0,37***	3,81±0,37 ***
Концентрація загального білка ммоль/л	22,64±2,78	22,64±2,78	22,64±2,78	22,64±2,78
	19,82±1,37	20,55±3,73	26,8±4,76	111,25±9,83 ***

Примітка. * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 щодо контролю

Аналіз літератури показує, що у людей, хворих на хронічний алкогольний панкреатит, зменшується секреція ліпази у шлунку впродовж цефалічної фази секреції [], а у мишей після чотирьох внутрішньошлункових введень 50% розчину етанолу зменшується протеолітична активність шлункового соку []. Отже, імовірно, в наших експериментах у 67% щурів впродовж 12 тижнів заміни пиття розчином етанолу не змінювалась структура ферментпродукуючих клітин, але міг відбуватись перерозподіл синтезу білкових компонентів шлункового соку при незмінному рівні загального білка. Істотне збільшення концентрації цього показника у інших 33% тварин може бути пов’язано з активацією синтезу і секреції протеолітичних ферментів клітинами шлункових залоз.

Відомо, що вміст гексозамінів у шлунковому вмісті свідчить про утворення шлункового слизу, якому належить функція захисту стінки шлунка від дії пошкоджуючих чинників. Результати наших досліджень показали, що впродовж перших чотирьох тижнів вживання етилового спирту концентрація гексозамінів в шлунковому секреті щурів істотно не змінювалась, проте при подальшій алкоголізації їх міліграмвідсотковий вміст зменшувався і наприкінці восьмого тижня відрізнявся від такого у контрольних показниках на 20,8% (р0,05). Споживання тваринами 20%-вого розчину етанолу впродовж дванадцяти тижнів спричинило зменшення вмісту гексозамінів на 31% (р0,01) порівняно з контролем (Табл.2).

Зменшення кількості гексозамінів впродовж розвитку хронічного алкогольного панкреатиту, свідчить про вразливість слизової оболонки шлунка до дії соляної кислоти, секреція якої при цьому підвищується. Таке порушення функції захисту шлунка може бути причиною запалення та утворення ерозій і виразок. При надмірному споживанні алкоголю схожі патології можна виявити у людей. Дані літератури свідчать, що у мишей, яким вводили етанол, зменшується кількість бокалоподібних клітин у слизовій оболонці шлунка, що призводить до зменшення секреції слизу [3]. Таким чином, в нашому експерименті слизова оболонка шлунка щурів стає більш вразливою до дії пошкоджуючих факторів, зокрема соляної кислоти, секреція якої при цьому підвищується. Це може бути причиною запалення та утворення ерозій і виразок слизової оболонки шлунка у щурів з хронічним алкогольним панкреатитом [3, 31]. Такі патології виникали при надмірному споживанні етанолу людьми [6]. Автори зробили висновок про підвищення проникності слизової оболонки шлунка під впливом етанолу, а також встановили, що тривале вживання алкоголю порушує мікроциркуляцію та призводить до структурних пошкоджень слизової оболонки шлунка. Ці стани можуть бути викликані зменшенням формування гормоноподібних субстанцій під впливом простагландинів, а також збільшенням продукції лейкотрієнів [6].

Оскільки амінокислоти та їх похідні належать до сполук, що можуть забезпечувати клітинну сигналізацію, здійснювати регуляцію експресії генів та каскаду фосфорилювання протеїнів, є ключовими прекурсорами синтезу гормонів, низькомолекулярними субстанціями азоту, а також регуляторами кишкової фази шлункової секреції ми дослідили зміни спектру амінокислот у шлунковому соці щурів з хронічним алкогольним панкреатитом. Отримані нами результати показали, що вже через 4 тижні щоденного споживання етанолу у шлунковому вмісті значно змінюється співвідношення вільних амінокислот (Табл.2).

Таблиця 2

Концентрації груп вільних амінокислот у шлунковому вмісті щурів впродовж розвитку експериментального хронічного алкогольного панкреатиту

(мг%; М±m)

	Тривалість алкоголізації
	4 тижнів	8 тижнів	12 тижнів
Цистеїн, цистин	0,4±0,03*	0,29±0,03	0,23±0,02*
Орнітин, лізин, аргінін	0,35±0,02*	0,26±0,02***	0,24±0,02***
Таурин, гістидин, серин	0,39±0,02	0,3±0,02	0,16±0,01***
Аспарагін, гістамін	0,06±0,003***	0,04±0,003	0,01±0,002***
Пролін, оксипролін	0,5±0,03	0,32±0,01***	0,19±0,01***
Гліцин, аспарагінова кислота	0,97±0,05**	0,47±0,03***	0,34±0,02***
Глутамінова кислота, треонін	0,5±0,03***	0,84±0,03	0,91±0,04
Аланін, метіонін	0,24±0,02**	0,44±0,02*	0,35±0,02
Валін, тирозин	0,06±0,01***	0,08±0,01***	0,03±0,004***
Лейцин, фенілаланін	0,54±0,02	0,62±0,03	0,78±0,04**
Ізолейцин, триптофан	0,44±0,02	0,45±0,03	0,63±0,04**

Примітка. * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 щодо контролю;

Порівнюючи концентрацію цистеїну і цистину дослідної проби з контрольною, встановили, що після 4 тижнів вживання етилового спирту концентрація даної групи вільних амінокислот зростала на 33,33 % (p<0,05). Через 8 тижнів від початку алкоголізації зміни концентрації цистеїну і цистину не були статистично значущими (p<0,05). Порівняльний аналіз вмісту аспірату дослідних і контрольних тварин показав, що вживання етилового спирту впродовж 12 тижнів призводить до зменшення концентрації амінокислот на 23,33 % (p<0,05) (Табл.2).

Результати отримані хроматографічним методом показали, що концентрація орнітину, лізину і аргініну у шлунковому соці при хронічному вживанні алкоголю відрізняється від такого показника у контрольних тварин. Впродовж експерименту концентрація цих вільних амінокислот була меншою від контролю на 18,6 % (p<0,05) після 4 тижнів, на 39, 53 % (p<0,001) після 8 тижнів та на 44,19 % (p<0,001) після 12 тижнів від початку споживання 20%-го розчину етилового спирту (Табл.2). Відомо, що аргінін покращує бар’єрну функцію слизової оболонки кишечника, зменшуючи ступінь її ушкоджень ліпополісахаридами ендотоксинів []. Ймовірно, ця амінокислота виконує подібну функцію і щодо слизової оболонки шлунка. Тому зрозуміло, що зменшення її міліграмвідсоткового вмісту в секреті сприяє утворенню геморагічних виразок. Разом з цим, дефіцит аргініну може призводити до зниження рівня оксиду азоту, звуження кровоносних судин і, як наслідок, ішемії стінки шлунка. Ці процеси можуть підтримуватись за рахунок зниження рівнів таурину, гліцину та лізину, які здатні запобігати перекисному окисненню ліпідів у клітинах та ішемічним пошкодженням.

Порівнюючи концентрацію таурину, гістидину та серину в аспіраті щурів, що вживали розчин етанолу впродовж 8 тижнів та контрольною групою тварин, що вживали водопровідну воду, статистично значущих відмінностей не виявлено. Значення цього показника в досліді після 4 тижнів (0,39±0,02 мг%) та після 8 тижнів (0,30±0,02 мг%) алкоголізації практично дорівнювали таким в контролі (0,34±0,02 мг%). Під впливом етилового спирту впродовж 12 тижнів концентрація даної групи амінокислот в аспіраті дослідних тварин зменшилась на 52,94 % (p<0,001) (Табл.2).

На відміну від попередньої групи вільних амінокислот вплив етанолу на концентрацію аспарагіну та гістаміну в аспіраті щурів дослідної групи було виявлено відразу. Після перших чотирьох тижнів експерименту концентрація амінокислот зросла порівняно з контролем на 50% (p<0,001). На 8-ому тижні вживання 20%-го розчину етилового спирту показник статистично значущо не відрізнявся від контролю (p>0,05). Через 12 тижнів хронічного споживання алкоголю вміст даної групи вільних амінокислот (0,01±0,002 мг%) зменшився на 75% (p<0,001) щодо такого у контролі (0,04±0,01мг%) (Табл.2).

Порівняльний аналіз концентрації проліну та оксипроліну в аспіраті тварин контрольної та дослідної груп після 4-х тижнів алкоголізації статистично значущої різниці не виявив. Впродовж 8 тижнів вживання 20%-го розчину етанолу концентрація амінокислот зменшилася на 30,43% (p<0,001). Дія етилового спирту протягом 12 тижнів призвела до зменшення такого показника на 58,7 % (Табл.2).

Результати наших досліджень показали, що після 4-ох тижнів вживання етанолу вміст гліцину та аспарагінової кислоти в дослідних пробах на 38,57% (p<0,01) більше, ніж в контролі. Впродовж наступних 4 тижнів досліду концентрація амінокислот зменшилася і після закінчення 8-го тижня алкоголізації була меншою ніж в контролі на 32,86 %, а після 12 тижня споживання етанолу на 51,43% (Табл.2).

При дослідженні шлункової секреції впродовж розвитку алкогольного панкреатиту встановлено, що концентрація глутамінової кислоти та треоніну змінювались лише впродовж перших чотирьох тижнів алкоголізації, зменшуючись 44,44 % (p<0,05) щодо контролю (Табл.2). Впродовж наступних 8-ми тижнів значення цього показника коливалось в межах контролю.

Після перших чотирьох тижнів вживавання тваринами розчину етилового спирту концентрація валіну і тирозину в аспіраті зменшилась на 70% (p<0,001). В наступні чотири тижні зміни концентрації вільних амінокислот в порівнянні з першими 4 тижнями досліду були менш вираженні, показник був на 60% (p<0,001) менше від такого в контролі. Після 12-ти тижнів споживання 20%-го розчину етилового спирту вміст валіну і тирозину у аспіраті був найменшим і відрізнявся від контролю на 85% (p<0,001) (Табл.2).

Впродовж вживання алкоголю дослідною групою тварин в аспіраті також спостерігались зміни вмісту аланіну та метіоніну. В перші 4 тижні досліду концентрація амінокислот зменшилась на 29,41% (p<0,01) порівняно з контролем. Після 8 тижнів алкоголізації такий показник збільшився на 29,41%(p<0,05). Подальше споживання етанолу статистично значущих змін не викликало, показники дослідної групи (0,35±0,02) майже не відрізнялись від таких у контролі (0,34±0,02) (Табл.2).

Змін концентрацій лейцину, фенілаланіну, ізолейцину та триптофану впродовж перших 8 тижнів розвитку панкреатиту виявлено не було. Отримані результати хроматографічного аналізу аспірату дослідної та контрольних груп тварин за цей термін статистично значущо не відрізнялись (p>0,05). Проте, після 12 тижнів алкоголізації концентрація лейцину та фенілаланіну в аспіраті зросла на 36,84 % (p<0,01) порівняно з контролем, а ізолейцину та триптофану збільшився на 61,54% (p<0,01) (Табл.2).

В літературі є дані про те, що L-ізоформи амінокислот алостерично зв’язуються з кальцій-чутливими рецепторами [8], розміщеними на базолатеральній та апікальній мембранах G-клітин, а також парієтальних клітин, активно регулюючи шлункову секрецію в нейрогуморальну фазу [14, 16]. Зв’язуючись з цими рецепторами на G-клітинах амінокислоти викликають вивільнення гастрину, який стимулює шлункову секрецію, а на парієтальних клітинах – безпосередньо активують H⁺-K⁺-АТФазу, що посилює секрецію соляної кислоти. Наявність кальцій-чутливих рецепторів показана також на епітеліоцитах, які продукують слиз у шлунку людей, а також на головних клітинах шлункових залоз щурів. Тому регуляція секреції пепсиногену і слизу також може відбуватись із залученням цих рецепторів. Максимальне збільшення секреції гастрину відбувається під впливом ароматичних амінокислот, зокрема фенілаланіну. В наших дослідах в шлунковому вмісті тварин суттєво збільшувалась концентрація фенілаланіну та лейцину. При цьому у всіх піддослідних щурів істотно зростала концентрація соляної кислоти в шлунковому вмісті та концентрація загального білка у третини тварин. Посилення секреції основних компонентів шлункового соку може бути пов’язане з активацією фенілаланіном і лейцином кальцій-чутливих рецепторів у слизовій оболонці шлунка. З іншого боку деякі роботи свідчать, що лейцин стимулює вивільнення інсуліну з β-клітин підшлункової залози [47]. Різке зниження рівня глюкози в крові під впливом інсуліну сприймається глюкосенситивними нейронами гіпоталамуса, котрий активує ядра блукаючих нервів і стимулює шлункову секрецію. Можливо, збільшення секреторних показників у нашому експерименті пов’язано із залученням цього механізму активації секреторного процесу. Відомо, що лейцин, аргінін і глутамін стимулюють фосфорилювання рапаміцинової мішені ссавців mTOR₁, яка фосфорилює еукаріотичний фактор ініціації трансляції 4Е-зв’язаний протеїн-1 і рибосомальну протеїн S6 кіназу-1, що призводить до ініціації синтезу білка [47]. Можливо, різна інтенсивність синтезу білків у щурів з алкогольним панкреатитом залежала від співвідношення міліграмвідсоткового вмісту зазначених амінокислот в клітинах залоз шлунка у окремих щурів. З іншого боку зв’язування фенілаланіну з Са²⁺-чутливими рецепторами лінії холецистокінінпродукуючих клітин проксимального відділу тонкого кишечника стимулює вивільнення холецистокініну, який активує секрецію ферментів підшлункової залози [44]. Можна припустити залучення цього механізму in vivo в нашому експерименті до розвитку панкреатиту у щурів після дванадцяти тижнів споживання алкоголю.

Впродовж усього терміну розвитку хронічного алкогольного панкреатиту в шлунковому соці поступово зменшувалась концентрація орнітину, лізину та аргініну. Відомо, що аргінін покращує бар’єрну функцію слизової оболонки кишечника, зменшуючи ступінь її ушкоджень ліпополісахаридами ендотоксинів [43]. Ймовірно, ця амінокислота виконує подібну функцію і щодо слизової оболонки шлунка. Тому зрозуміло, що зменшення її міліграмвідсоткового вмісту в секреті сприяє утворенню геморагічних виразок. Разом з цим, дефіцит аргініну може призводити до зниження рівня оксиду азоту, звуження кровоносних судин і, як наслідок, ішемії стінки шлунка. Ці процеси можуть підтримуватись за рахунок зниження рівнів таурину, гліцину та лізину, які здатні запобігати перекисному окисненню ліпідів у клітинах та ішемічним пошкодженням [43].