3 курс / Фармакология / Синтез_и_изучение_свойств_новых_материалов_с_противоопухолевой
.pdf101
контроль |
50 |
/T |
|
GO-1.57 |
50 |
T |
2.4
2.1
1.8
1.5
1.2
0.9
0.6
0.3
0.0
0 |
10 |
25 |
50 |
75 |
100 |
C / мг∙л-1
Рис. 3.51. Концентрационная зависимость степени фотогемолиза в присутствии
GO-1.57. С — молярная концентрация GO-1.57 в пересчёте на содержание соединения 1.57, Т50GO-1.57 — время фотоиндуцированного гемолиза 50 % в присутствии GO-1.57, T50контроль — время фотоиндуцированного гемолиза 50 %
эритроцитов в присутствии физиологического раствора.
3.8.1.3. Плазмо-коагуляционный гемостаз
Как видно из представленных данных (Табл. 3.18), GO-1.57 в исследованном диапазоне концентраций достоверно увеличивает АПТВ по сравнению с контролем.
Индивидуальное соединение 1.57 в диапазоне концентраций 5–200 мкМ также проявляло антикоагулянтные свойства, статистически значимо увеличивало время АПТВ по сравнению с контролем [116]. В свою очередь было показано, что конъюгат GO-1.57 незначительно снижал ПВ. Таким образом, антикоагулянтные свойства конъюгата GO-1.57 сопоставимы с индивидуальным соединением 1.57
[116].
Табл. 3.18. Влияние GO-1.57 на показатели плазмо-коагуляционного гемостаза.
|
|
|
|
|
С / мг∙л−1 |
|
|
|
Тест |
Норма |
Контроль |
10 |
25 |
50 |
75 |
100 |
200 |
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ПВ/ с |
15–19 |
17,7 |
13,0* |
12,8* |
12,1* |
12,4* |
13,0* |
12,7* |
АПТВ/ с |
35–45 |
41,5 |
65,0* |
61,9* |
63,3* |
63,9* |
61.1* |
63,8* |
*p < 0,05.
102
3.8.1.4. Агрегация тромбоцитов
Как видно из данных, представленных в Табл. 3.19, в тестах АДФ-
индуцированной агрегации тромбоцитов в присутствии конъюгата GO-1.57 в
диапазоне концентраций 5–100 мг∙л−1 наблюдается статистически значимое дозозависимое снижение агрегации тромбоцитов по сравнению контролем.
Табл. 3.19 Влияние конъюгата GO-1.57 на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов.
Параметр |
|
Амплитуда / % |
|
|
|
|||
Индуктор |
Контроль |
|
|
С / мг∙л−1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
||
|
5 |
10 |
25 |
50 |
75 |
|
100 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
78,6 ± |
70,1 ± |
66,6 ± |
58,7 ± |
53,2 |
± |
42,4 ± |
|
АДФ |
79,3 ± 5,9 |
|
|
|
|
|
|
|
|
4,5 |
2,0 |
1,9 |
2,5* |
2,1* |
2,1* |
*p < 0,05.
3.8.2. Антиоксидантная активность
3.8.2.1. Антирадикальная активность
На Рис. 3.52 представлен график зависимости доли восстановленных радикалов ДФПГ (% ингибирования) от концентрации конъюгата GO-1.57. Можно сделать вывод, что антирадикальная активность GO-1.57 возрастает с увеличением концентрации (C = 0,25–25,0 мг·л−1). Так как доля восстановленных радикалов составляет менее 50 %, рассчитать IC50 не представляется возможным. Также следует отметить, что GO-1.57 проявляет более выраженную антирадикальную активность по сравнению с GO, что в свою очередь связано с функционализацией поверхности GO. Из данных, представленных в разделе 3.5.3.1 следует, что соединение 1.57 активно реагирует с ДФПГ (k = (2,43 ± 0,06)·10−3 мин−1 при 303,15
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
103
К). Таким образом, можно заключить, что соединение 1.57 сохраняет свою антирадикальную активность после нековалентной конъюгации с GO [117].
50 |
|
|
|
|
40 |
|
|
|
|
30 |
|
|
|
|
A |
|
|
|
|
20 |
|
|
|
|
10 |
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
2.5 |
6.25 |
12.5 |
18.75 |
25 |
|
|
C / мг·л-1 |
|
|
Рис. 3.52. Зависимость доли восстановленных радикалов (% ингибирования) от концентрации GO (светло-серый) и GO-1.57 (тёмно-серый) в пересчёте на загрузку соединения 1.57.
3.8.2.2. Фотодинамические свойства
Фотодинамические свойства оценивали, определяя константу скорости фотодеградации kdeg (Табл. 3.20). Спектры поглощения Радахлорина регистрировали в отсутствие и в присутствии GO-1.57 (C = 10, 50, 75 и 100 мг∙л−1) и азида натрия (C
= 500 мкМ). На Рис. 3.53 представлены зависимости в координатах ln(A0 / At) – t для реакции фотодеградации Радахлорина, Радахлорина в присутствии конъюгата GO- 1.57 и Радахлорина в присутствии азида натрия.
|
|
|
104 |
|
|
|
1.0 |
|
|
|
|
|
0.9 |
|
|
|
|
|
0.8 |
|
|
|
|
|
0.7 |
|
|
|
|
) |
|
|
|
|
|
t |
0.6 |
|
|
|
|
A |
|
|
|
|
|
/ |
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
A |
0.5 |
|
|
|
|
ln( |
|
|
|
|
|
|
0.4 |
|
|
|
|
|
0.3 |
|
|
|
|
|
0.2 |
|
|
|
|
|
0.1 |
|
|
|
|
|
0.0 |
|
|
|
|
|
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
|
|
|
время / с |
|
|
Рис. 3.53. Кинетическая зависимость фотодеградации Радахлорина (■) в
присутствии GO-1.57 (▲ 10 мг∙л−1, ▼ 25 мг∙л−1, 50 мг∙л−1, ● 75 мг∙л−1) по сравнению с азидом натрия (◄ 500 мкМ). A0 и At — оптические плотности растворов Радахлорина при длине волны 663,9 нм до и после облучения.
В Табл. 3.20 приведены значения kdeg для процесса фотодеградации Радахлорина в присутствии GO-1.57 и азида натрия. Представленные значения kdeg
свидетельствуют о том, что в присутствии GO-1.57 наблюдается уменьшение kdeg
Радахлорина, что свидетельствует об антиоксидантных свойствах конъюгата GO-
1.57.
Табл. 3.20. Константы фотодеградации (kdeg) Радахлорина в присутствии GO-1.57 и
азида натрия. С — концентрация в пересчёте на содержание соединения 1.57.
Агент |
C / мг·л−1 |
kdeg / с−1 |
—— 0,0123 ± 0,0017 10 0,0124 ± 0,0015
GO-1.57 |
25 |
0,0084 ± 0,0007 |
|
50 |
0,0075 ± 0,0022 |
||
|
|||
|
75 |
0,0071 ± 0,0012 |
|
NaN3 |
100 |
0,0042 ± 0,0020 |
|
|
|
|
3.8.2.3. Связывание NO-радикалов
Из данных, представленных на Рис. 3.54 видно, что конъюгат GO-1.57
поглощает NO-радикалы, хотя и в меньшей степени, чем азид натрия и индивидуальное соединение 1.57 (Раздел 3.5.3.4) [116]. Следовательно,
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
105
нековалентная конъюгация GО с соединением 1.57 снижает его антирадикальную активность в реакции взаимодействия с радикалом NO [117].
0.6 |
|
|
|
|
|
|
0.4 |
|
|
|
|
|
|
A |
|
|
|
|
|
|
0.2 |
|
|
|
|
|
|
0.0 |
|
|
|
|
|
|
0 |
10 |
25 |
50 |
75 |
100 |
200 |
|
|
|
C / мг·л-1 |
|
|
|
Рис. 3.54. Антирадикальная активность конъюгата GO-1.57 (светло-серый) и азида
натрия (темно-серый) в реакции захвата NO-радикалов.
3.8.3. Генотоксичность
Средние значения % содержания ДНК в хвосте кометы, длины хвоста и момента хвоста комет, наблюдаемые из МКПК человека, инкубированных в присутствии H2O2 (положительный контроль), PBS (отрицательный контроль) и GO- 1.57, представлены в Табл. 3.21. Видно, что количество повреждений ДНК в присутствии H2O2 значительно выше, чем у контрольных клеток. В качестве примера на Рис. 3.55 представлены микрофотографии ДНК-комет в присутствии H2O2 (C =
100 мкМ), PBS, и конъюгата GO-1.57 в диапазоне концентраций 1–200 мкМ.
Показано, что инкубация МКПК человека с конъюгатом GO-1.57 вызывает дозозависимое повреждение целостности ДНК (Рис. 3.55).
|
106 |
|
(а) |
(б) |
(в) |
(г) |
(д) |
(е) |
(ж)
Рис. 3.55. ДНК-кометы после электрофореза клеток в микрогеле: (а) —
положительный контроль (H2O2), (б) — отрицательный контроль (PBS), (в–ж) —
GO-1.57 (в молярных концентрациях в пересчёте на соединение 1.57, C = 10, 25,
50, 75 и 100 мкМ).
3.8.4. Изучение термодинамических параметров связывания GO-1.57 с ЧСА калориметрическим методом
Термические эффекты, наблюдаемые в процессе титрования ЧСА водными дисперсиями GO-1.57 (C = 5·10−3 М в пересчёте на содержание вещества 1.57) (Рис. 3.56), представляют собой теплоты смешения титранта и титруемого вещества.
Аналогичный результат был получен при титровании ЧСА соединением 1.57.
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Табл. 3.21. Влияние GO-1.57 на хвост ДНК (%), длину хвоста и хвостовой момент.
|
|
|
Амплитуда / % |
|
|
|
||
Изучаемая |
Отрицательный |
Концентрация |
|
|
С / мкM |
|
|
|
характеристика |
контроль |
H2О2 / мкM |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,0 |
100,0 |
10,0 |
25,0 |
50,0 |
75,0 |
100,0 |
|
Хвост ДНК, % |
6,95 ± 0,88 |
86,25 ± 16,88 |
77,61 ± 2,11 |
74,62 ± 2,04 |
74,14 ± 2,04 |
82,50 ± 1,71 |
83,15 ± 2,07 |
|
Длина хвоста/ |
42,00 ± 2,49 |
98,69 ± 7,18 |
139,26 ± 9,12 |
137,90 ± 4,90 |
151,42 ± 11,23 |
104,80 ± 6,40 |
146,37 ± 8,62 |
|
мкм |
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
||
Хвостовой |
4,12 ± 0,02 |
85,22 ± 1,21 |
108,10 ± 0,19 |
102,85 ± 0,10 |
112,27 ± 0,30 |
86,46 ± 0,11 |
111,85 ± 0,17 |
|
момент |
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
107
108
Можно сделать вывод, что отсутствие связывания как соединения 1.57, так и его конъюгата GO-1.57 с ЧСА свидетельствует о том, что ЧСА не будет выполнять транспортную функцию в кровотоке [117].
|
-158 |
|
|
|
|
|
|
|
-160 |
|
|
|
|
|
|
-1 |
|
|
|
|
|
|
|
мкДж•с |
-162 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
/ |
-164 |
|
|
|
|
|
|
H |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
-166 |
|
|
|
|
|
|
|
-168 |
|
|
|
|
|
|
|
2000 |
4000 |
6000 |
8000 |
10000 |
12000 |
14000 |
|
|
|
|
время / с |
|
|
|
Рис. 3.56. Зависимость теплового эффекта реакции взаимодействия конъюгата GO-
1.57с ЧСА от времени при 298,15 К.
3.8.5.Цитотоксичность конъюгата GO-1.57
Анализ полученных данных по цитотоксичности GO-1.57 показывает дозозависимое снижение выживаемости клеток линий A549 (Рис. 3.57а), PANC-1
(Рис. 3.57б) и HeLa (Рис. 3.57в). Из представленных данных следует, что максимальная цитотоксичность GO-1.57 была достигнута на клеточной линии HeLa
при IC50 = 2,5 мкМ. Данный эффект сопоставим с доксорубицином (IC50 = 1,5 мкМ)
и более чем в 4,5 раза превосходит цитотоксическое действие индивидуального соединения 1.57 (IC50 = 11,8 мкМ) [116,117]. Важно отметить, что GO-1.57 обладает значительно меньшей цитотоксичностью в отношении клеточной линии HEK 293 по сравнению с доксорубицином, а также по сравнению с соединением 1.57 (более, чем в 1,5 раза).
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
(а)
|
100 |
|
|
|
|
|
|
|
/ % |
|
|
|
|
|
|
|
|
клеток |
80 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Выживаемость |
60 |
|
|
|
|
|
|
|
40 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
20 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
1.56 |
3.13 |
6.25 |
12.5 |
25 |
50 |
100 |
|
|
|
|
C / μM |
|
|
|
|
109
|
|
|
|
(б) |
|
|
|
|
|
120 |
|
|
|
|
|
|
|
% |
100 |
|
|
|
|
|
|
|
/ |
|
|
|
|
|
|
|
|
клеток |
80 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Выживаемость |
60 |
|
|
|
|
|
|
|
40 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
20 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
1.56 |
3.13 |
6.25 |
12.5 |
25 |
50 |
100 |
|
|
|
|
C / μM |
|
|
|
|
|
|
|
|
(в) |
|
|
|
|
|
120 |
|
|
|
|
|
|
|
|
100 |
|
|
|
|
|
|
|
/ % |
80 |
|
|
|
|
|
|
|
клеток |
60 |
|
|
|
|
|
|
|
Выживаемость |
|
|
|
|
|
|
|
|
40 |
|
|
|
|
|
|
|
|
20 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
1.56 |
3.13 |
6.25 |
12.5 |
25 |
50 |
100 |
|
|
|
|
C / μM |
|
|
|
|
Рис. 3.57. Влияние GO-1.57 на выживаемость клеток опухоли шейки матки HeLa
(a), влияние GO-1.57 на выживаемость клеток опухолевой линии альвеолярной аденокарциномы человека A549 (б), влияние GO-1.57 на выживаемость клеток опухолевой линии рака поджелудочной железы человека PANC-1 (в).
3.8.6. Изучение механизмов эндоцитоза конъюгата GO-1.57
Механизмы эндоцитоза изучались в присутствии следующих ингибиторов:
CK-636 (ингибитор актин-зависимого эндоцитоза), нистатин (ингибитор кавеолин-
зависимого эндоцитоза), диносор (ингибитор динамин-зависимого эндоцитоза),
хлорпромазин (ингибитор клатрин-зависимого эндоцитоза), амилорид (ингибитор пиноцитоза). Ингибиторы эндоцитоза использовались в концентрации C = 10 мкM.
110
Данные по цитотоксичности в присутствие ингибиторов сравнивались с контролем в отсутствие ингибиторов.
Анализ полученных данных показывает, что в присутствии ингибитора эндоцитоза амилорида увеличивается выживаемость клеток линии HeLa при добавлении конъюгата GO-1.57 (Рис. 3.58). Также выживаемость клеток линии HeLa
увеличивается в присутствии хлорпромазина. Следовательно, транспорт конъюгата
GO-1.57 в клетки возможен по двум механизмам: пиноцитоз и клатрин-зависимый эндоцитоз.
|
100 |
|
|
|
|
|
|
, % |
80 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Выживаемость |
60 |
|
|
|
|
|
|
40 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
20 |
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
Контроль |
GO-1.57 |
Амилорид |
CK-636 |
Диносор |
Хлорпромазин |
Нистатин |
|
|
|
GO-1.57 |
GO-1.57 |
GO-1.57 |
GO-1.57 |
GO-1.57 |
Рис. 3.58. Влияние ингибиторов эндоцитоза на выживаемость клеточной линии HeLa в присутствии конъюгата GO-1.57 (C = 2,5 мкМ в пересчёте на индивидуальный цитостатик).
Так, синтезированный конъюгат являются гемосовместимым, имеет потенциал применения в фотодинамической терапии, и обладает клеточно-
специфической цитотоксичностью, следовательно, GO может быть эффективно использован для разработки системы адресной доставки соединения 1.57 к
опухолевым мишеням [117].
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/