3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

6.1. Некоторые методы получения ТЛН

ТЛН представляют собой эмульсии, в состав которых входят липиды с высокой температурой плавления, а также лекарственные вещества, которые могут медленно высвобождаться из частиц в течение нескольких суток или недель. Их получают посредством гомогенизации под давлением, различными методами микроэмульгирования или методом инъекции в растворитель.

6.1.1. Гомогенизация под давлением

Гомогенизация под давлением включает два основных подхода: гомогенизацию расплавленной фазы липида при повышенной температуре (горячая гомогенизация) и гомогенизация твердого липида при комнатной или пониженной температуре (холодная гомогенизация). В обоих случаях, до проведения гомогенизации, лекарственное вещество необходимо предварительно растворить в липиде, что достигается прогревом смеси до температуры на 5 – 10 º С выше температуры плавления липида.

При горячей гомогенизации подогретый раствор липида с лекарством диспергируют в горячем водном растворе сурфактанта при быстром перемешивании. Полученную предварительную эмульсию помещают в гомогенизатор высокого давления (100 – 1500 бар). После нескольких циклов гомогенизации суспензию охлаждают ниже температуры плавления липидов, что приводит к образованию липидных наночастиц с кристаллической внутренней структурой. Эта процедура применима для инкапсулирования жирорастворимых лекарств, но не подходит для водорастворимых веществ, которые остаются в водном растворе.

201

При гомогенизации ниже температуры плавления липида на 5 – 10 º С предварительно растворенные в липиде лекарства не высвобождаются в водное окружение и остаются захваченными внутри частиц. Для улучшения растворимости гидрофильных лекарств в липиде, на стадии, предшествующей гомогенизации, в расплавленную смесь липида и лекарства добавляют сурфактанты, что способствует образованию инвертированных мицелл, внутри которых находится лекарственное вещество. Расплав липида с лекарством охлаждают с помощью сухого льда или азота после чего перемалывают до образования частиц 50 – 100 мкм, которые диспергируют в охлажденном водном растворе сурфактанта. Эту суспензию далее гомогенизируют при пониженных температурах до получения наночастиц нужного размера. Таким путем можно получать суспензии лекарств, чувствительных к нагреву, поскольку время действия повышенных температур может быть весьма ограниченным.

В целом, достоинством метода гомогенизации под давлением является получение довольно гомогенной суспензии наночастиц с небольшим количеством частиц микронных размеров, отсутствием органических растворителей, возможностью производить суспензии в любых необходимых количествах вплоть до больших промышленных объемов.

6.1.2. Получение СЛН из микроэмульсий масло/вода

Эта процедура подробно описана в обзоре [332]. Водные микроэмульсии можно получать быстрым перемешиванием тугоплавкой жирной кислоты, например, стеариновой кислоты, при температуре плавления (Tm 70ºС) в присутствии эмульсификатора (полисорбат 20 + полисорбат 60 + соевый фосфатидилхолин + тауродиоксихолат натрия) и соэмульсификатора – монооктилфосфата натрия) до получения прозрачной смеси [1410]. После этого, полученная горячая микроэмульсия диспергируется в холодной воде (2 – 3 º С) при быстром перемешивании. Обычно, соотношение объема горячей микроэмульсии к холодной воде должно составлять от 1 : 25 до 1 : 50. Процесс разведения чрезвычайно важен, поскольку определяет состав и структуру микроэмульсии. Кроме того, было показано, что уже в процессе приготовления горячей микроэмульсии образуются субмикронные частицы, которые быстро затвердевают при разведении в холодной воде, где они могут сохраняться длительное время [1411]. Поэтому, размер частиц может определяться скоростью перемешивания горячей микроэмульсии.

6.1.3. Получение СЛН эмульсификацией

Липофильный материал растворяют в органическом растворителе, не смешивающимся с водой, например, в циклогексане, который затем

202

эмульгируется в водной фазе. Далее растворитель выпаривают, в результате чего образуется суспензия наночастиц в воде. При этом размер наночастиц из ацетата холестерина и эмульсификатора, содержащего смесь лецитина и гликохолата натрия, составляет около 25 нм [1412,1413].

6.2. Некоторые методы приготовления липосом

Размер и количество бислоев являются важными параметрами липосом. Липосомы должны иметь строго определенный размер. Для доставки водорастворимых лекарств чаще всего используются моноламеллярные липосомы, которые характеризуются наибольшей величиной соотношения внутреннего объема к поверхности. Кроме того, при необходимости, в таких липосомах можно инициировать появление дефектов бислоя, что способствует высвобождению внутреннего содержимого в нужный момент и в нужном месте. Если требуется доставка плохо растворимых в воде веществ, которые, однако, хорошо растворимы в фосфолипидном бислое (липофильные вещества), более пригодными будут мультиламеллярные липосомы. Липофильные вещества медленно выходят из мультиламеллярных липосом в окружающий водный раствор в соответствии с коэффициентом их распределения в системе вода-масло, а также скоростью проникновения через многочисленные бислойные структуры липидов. Благодаря способности проникать через мембраны такие вещества могут высвобождаться не только из внешних, но и из внутренних бислоев мультиламеллярных липосом.

Существует много методов получения липосом. Стандартные процедуры могут включать использование органических растворителей или детергентов, присутствие которых нежелательно в конечном продукте.

6.2.1 Мультиламеллярные липосомы.

Для получения мультиламеллярных липосом наиболее пригоден фосфатидилхолин. Можно использовать природные фосфатидилхолины из таких источников как яичный желток или соя. Синтетические фосфатидилхолины образуют устойчивый бислой, если длина углеводородный цепей составляет не менее 12 атомов углерода. Наиболее часто используются цепи с длиной 14 – 18. При этом они могут быть насыщенными, или иметь одну или две двойные связи. Мультиламеллярные везикулы (MLV) обычно получают также из смеси фосфатидилхолина с некоторыми нейтральными или заряженными липидами, общее количество которых может достигать 50 – 70%. При использовании смесей липидов необходимо проверять, действительно ли образуются мультиламеллярные липосомы, с помощью методов электронной микроскопии.

Процедура начинается с растворения липидов в органическом растворителе (Рис. 1). Наиболее универсальным растворителем для этих це-

203

лей является хлороформ или смесь хлороформа с метанолом. Природные липиды часто хорошо растворимы в этиловом спирте. В некоторых случаях липиды растворяют в трет-бутаноле или в циклогексане. Обычно используют концентрации 10 – 20 мг липида на 1 мл органического растворителя. Более высокие концентрации также возможны, если липид хорошо растворим в соответствующем растворителе. Важным критерием является получение прозрачного раствора. После полного растворения липида органический растворитель необходимо удалить. Для этого годится вакуумный ротационный испаритель.

Рис. 1. Процедура получения липосом. Липид или смесь липидов в органическом растворителе помещают в стеклянный сосуд (а). Растворитель удаляют в струе аргона или азота и высушивают под вакуумом, в результате чего на стенках сосуда образуется пленка липида (б). Далее в сосуд добавляют воду (буфер) в котором липиды гидратируются путем интенсивного встряхивания при температуре >Tm. В результате этой процедуры некоторые липиды, например, фосфатидилхолины образуют MLV (в). Моноламеллярные везикулы меньшего размера получают из MLV при обработке ультразвуком или экструзией.

В последние годы наибольшую популярность получил способ испарения в струе аргона или азота. Для этих целей желательно использовать стеклянную посуду. После полного испарения жидкости сосуд, с пленкой липида на стенках, помещают под вакуум для полного удаления растворителя. Для вакуумирования годится масляный ротационный насос, позволяющий получить вакуум не менее 10-3 мм.рт.ст. В зависимости от количества используемого липида вакуумирование может продолжаться в течение 1 – 24 час. Чтобы убедиться в том, что растворитель действительно полностью удален, можно использовать взвешивание на достаточно точных весах. Вакуумировать необходимо до тех пор, пока вес не перестанет изменяться. При длительном вакуумировании необходимо учитывать возможность загрязнения препарата потоком паров масла из насоса. Для предотвращения этого между насосом и вакуумируемой камерой можно поставить ловушку, охлаждаемую жидким азотом. Если ловушка недоступна, можно производить кратковременное откачивание воздуха

204

(10 – 15 мин), после чего перекрывать клапан и оставлять препарат под вакуумом на несколько часов. Эту процедуру желательно повторить несколько раз.

В некоторых случаях, при приготовлении липосом, содержащих липофильные лекарственные препараты, липиды вместе с лекарством растворяют в органическом растворителе, после чего охлаждают на сухом льду (-78° С) и лиофилизируют в течение 1 – 3 суток.

Для получения мультиламеллярных липосом достаточно гидратировать высушенную на стенках сосуда пленку в воде или подходящем буфере (Рис. 2.). Для этих целей можно использовать механические приспособления, например, вортекс или шейкер. Процедуру необходимо продолжать не менее часа при температуре выше плавления соответствующих липидов (T > Tm). Для достижения полной гидратации и уравновешивания системы иногда рекомендуется оставить суспензию на ночь.

Рис. 2. Процесс формирования липосом при гидратации высушенной на стекле пленки. а – пленка содержит множество слоев липида. б - в результате гидратации пленка набухает и отделяется от поверхности стекла. в – фрагменты пленки образуют замкнутые мультиламеллярные липосомы. г – моноламеллярные липосомы получают путем разрушения мультиламеллярных липосом.

6.2.2. Дезинтеграция липосом ультразвуком.

Ультразвуковые липосомы получают из мультиламеллярных липосом путем обработки в подходящем ультразвуковом устройстве. Ультразвуковая дезинтеграция может производиться путем погружения волновода в сосуд с липосомами или путем погружения сосуда с липосомами в ультразвуковую ванну, заполненную водой (Рис. 3.).

Рис.3. Ультразвуковая обработка липосом путем погружения волновода в суспензию (а) или путем погружения сосуда с липосомами в ультразвуковую ванну, заполненную водой (б). В последнем случае время обработки существенно возрастает, т.к. ультразвук должен проходить через стекло, что снижает интенсивность воздействия. Сосуд с липосомами может быть герметизирован и заполнен инертным газом для предотвращения окисления.

205

При погружении волновода в суспензию липосом в препарат могут попадать металлические частицы, образующиеся при разрушении волновода ультразвуком. Их можно удалить центрифугированием. Кроме того, действие ультразвука связано с возникновением кавитационных пузырьков в которых происходит сильное повышение температуры, в результате чего могут ускоряться нежелательные химические процессы, например, перекисное окисление. Поэтому перед ультразвуковой обработкой суспензию липосом желательно насытить инертным газом. В результате ультразвуковой обработки образуются моноламеллярные липосомы малого размера 15 – 50 нм [1414,1415], которые принято называть малыми мо-

ноламеллярными везикулами (small unilamellar vesicles – SUV).

6.2.3.Экструзия липосом

Метод получения моноламеллярных липосом заданного размера основан на экструзии больших мультиламеллярных липосом через поликарбонатную мембрану с отверстиями. Обычно используются мембраны с калиброванными отверстиями с диаметром 100 или 200 нм. Однако в продаже имеются мембраны с диаметром отверстий от 30 нм до 5 мкм. В результате экструзии получаются моноламеллярные мембранные липосомы с диаметром, соответствующим размеру пор. Такие липосомы принято называть большими моноламеллярными везикулами (large unilamellar vesicles LUV) поскольку их размер больше, чем SUV, получаемых ультразвуковой обработкой (см. выше). Данный подход был впервые предложен в 1979 г. [1416] и в последствии получил широкое распространение. В настоящее время экструзия является одним из наиболее широко используемых методов получения липосом [1417,1418].

Экструзия является единственным надежным методом получения моноламеллярных липосом строго заданного размера. В сравнении с ультразвуковой обработкой к его достоинствам относятся также мягкое воздействие на липиды, не приводящее к химическим изменениям, и отсутствие загрязнений препарата металлическими фрагментами. По сравнению с методом испарения в обращенной фазе [1419], экструдированные липосомы не содержат остатков органического растворителя. В процессе получения липосом не возникает проблем с удалением детергента, как при получении липосом путем растворения в детергенте и последующего диализа [1420]. Достоинствами экструзии относятся быстрота получения липосом, широкий диапазон объемов обрабатываемых суспензий. Так, имеются различные конструкции дезинтеграторов, позволяющих работать с объемами от 100 мкл до > 1 л. Заслуживает внимания также сравнительно небольшая стоимость оборудования и временных затрат на получение липосом, как в лабораторных условиях, так и в промышленных масштабах.

206

Наиболее прост и удобен в лабораторных условиях экструдер Аванти [1421,1422], позволяющий получать 100 – 250 мкл суспензии липосом, что достаточно для биофизических исследований (Рис. 4 а). Обычно в эксперименте используют концентрацию липида до 20 мг/мл. Имеются сообщения об успешной экструзии суспензии липосом из яичного лецитина с концентрацией 200 мг/мл и более через поры 100 нм [1418]. Возможность использования высококонцентрированных суспензий является уникальными достоинством метода экструзии.

Рис. 4. Внешний вид (а) и схематическое изображение (б) лабораторного мини-

экструдера Аванти (Avanti® Mini-Extruder. Производитель Avanti Polar Lipids. INC) для получения моноламеллярных липосом заданного размера. Внешний вид (в) лабораторного экструдера Лепекс (LEPEXTM extruder), разработанного в 1985 г. Производи-

тель Northern Lipids (Vancouver, BC, Canada). Рабочий объем 10 мл. Имеются конст-

рукции на 100 мл и 800 мл. Экструдер снабжен термостатируемой водяной рубашкой, что позволяет проводить экструзию при заданной температуре. Сверху виден порт для быстрой загрузки и выгрузки материала. Аппарат присоединяется к баллону с инертным газом высокого давления. Подробности смотри на сайте: (http://www.northernlipids.com/). Показано также изменение размера липосом (в) в процессе экструзии яичного лецитина (25 мг/мл) в деионизованной воде с помощью экструдера Аванти. Мультиламеллярные липосомы экструдировали через поликарбонатную мембрану с размером отверстий 100 нм. Подробности можно найти на сайте (http://www.avantilipids.com/).

Для экструзии один из шприцов (слева) заполняют суспензией мультиламеллярных липосом, после чего суспензию продавливают через поликарбонатную мембрану во второй шприц (справа). На следующем этапе суспензия продавливают в обратном направлении. Процедуру необходимо

207

повторять не менее 11 раз. Нечетное число предполагает, что при последнем продавливании готовый продукт окажется в шприце справа, т.е. в пространстве, не содержащем остатков мультиламеллярных липосом. Для липидов с температурой плавления выше комнатной имеется специальный термостатируемый держатель.

Для обработки больших объемов суспензии липидов в лабораторных условиях можно использовать экструдер Лепекс (Рис. 4 в), который широко распространен в лабораториях, специализирующихся на исследованиях доставки лекарственных веществ с помощью липосом. Данное устройство позволяет многократно продавливать суспензию через поликарбонатную мембрану в прямом и обратном направлениях. Имеется приспособление для термостатирования рабочей камеры.

6.2.4.Механизм экструзии.

При экструзии температура суспензии должна быть выше температуры плавления липидов, что существенно облегчает процесс продавливания липидов через поры. При этом, скорость экструзии может возрастать с сотни раз. Дальнейшее повышение температуры не приводит к существенным изменениям. Примечательно, что даже в присутствии 45 моль.% холестерина экструзия липосом существенно облегчается при температуре плавления фосфатидилхолина [1418], хотя принято считать, что такие количества холестерина элиминируют фазовый переход фосфолипидов. Кроме того, экструзия существенно облегчается, если в среде присутствует 10 – 25 моль% этанола. Присутствие этанола не препятствует использованию липосом, если впоследствии препарат подлежит разведению в большем объеме воды.

В процессе экструзии большие мультиламеллярные липосомы с силой продавливаются через малые отверстия (Рис. 5). При этом происходит фрагментация мультиламеллярных структур. Действительно, измерения показывают, что для уменьшения размеров частиц необходимо приложить силу большую, чем необходимо для простой деформации липосом и достаточную для разрыва бислоя [1423]. Было отмечено также, что при увеличении скорости потока жидкости через поры размеры липосом уменьшаются. Это связано с образованием потока жидкости между движущейся липосомой и стенками поры, которая выполняет роль смазки. Предполагается, что толщина слоя смазки возрастает при увеличении скорости потока, что приводит к уменьшению эффективного диаметра поры и, соответственно, к уменьшению диаметра липосом [1423,1424].

После фрагментации происходит замыкание бислоя с образованием везикул меньшего размера и ламеллярности. Замыкание везикул происходит потому, что гидрофобные края незамкнутых фрагментов обращены в воду, что термодинамически не выгодно. В процессе фрагментации про-

208

исходит обмен между внутренним водным пространством липосом и окружающей средой. В этот момент везикулы могут захватывать водорастворимые лекарства. При этом происходит уравнивание концентрации веществ внутри везикул и во внешней среде. Для получения липосом, максимально загруженных лекарством во внутреннем пространстве, удаление лекарственных веществ из внешней среды можно производить только по окончании формирования моноламеллярных везикул [1418].

Рис. 5. Последовательные стадии фрагментации липосом в процессе экструзии. Большие мультиламеллярные липосомы (а) с потоком жидкости под давлением устремляются к порам поликарбонатной мембраны. При прохождении через поры происходит сильная деформация и фрагментация бислоя в результате чего размеры липосом и количество ламелл уменьшаются (б). При многократном повторении процедуры экструзии образуются моноламеллярные везикулы (в), которые при прохождении через поры могут деформироваться и терять части внутреннего содержимого. Для восстановления исходной сферической формы внутрь везикул должна войти вода. В буферных растворах, содержащих вещества, не способные проникать через бислой (например, >10 мМ NaCl), восстановлению исходного объема мешают осмотические силы и липосомы сохраняют цилиндрическую форму (г), тогда как в дистиллированной воде сферическая форма быстро восстанавливается [1425].

После экструзии часть везикул может сохранять мультиламеллярность, особенно при использовании поликарбонатных мембран с большим размером пор. Размеры и ламеллярность липосом после экструзии можно оценить методами электронной микроскопии. Для количественной оценки соотношения мультиламеллярных к моноламеллярным липосомам можно использовать ядерный магнитный резонанс по фосфору (31Р-ЯМР). Добавляя во внешнюю среду непроникающие через бислой парамагнитные или уширяющие сигнал реагенты можно оценить количество липида, экспонированного во внешнюю среду и количество липида, находящегося во внутреннем пространстве липосом [1426,1427]. Экспериментально показано, что в моноламеллярных липосомах 100 нм диаметром примерно 50% липида находится во внутреннем монослое. Повышению процента моноламеллярных везикул может способствовать также предварительное замораживание-оттаивание мультиламеллярных везикул. Важно, чтобы при оттаивании температура была выше точки плавления липидов. При этом количество моноламеллярных везикул превышает 90% в липосомах, экструдированных через поры 200 нм.