! За счет энергии реакции III комплекс, как и комплекс I переносит несколько H+ в межмембранное пространство митохондрий.
3 этап: IV Ферментный комплекс – цитохромоксидаза (цитохром-c-оксидаза).
Это сложный олигомерный белок, включающий
2 протомера-гемопротеина: цитохром a и цитохром a3, каждый из которых содержит центр связывания с O2.
Цитохромы a и a3 содержат гем (Fe3+), а также ионы
Cu2+.
Ионы Fe3+ гема, а также ионы Cu2+ участвуют в переносе электронов на O2:
|
3+ |
- |
|
2+ |
Fe |
2++ e- |
→ Fe |
+ |
|
Cu |
+ e → Cu |
Кислород, поступающий в митохондрии из крови, связывается с атомом Fe в геме цитохрома a3 в форме молекулы O2 (подобно тому, как он связывается с гемоглобином).
Цитохромоксидаза имеет гораздо более низкую Км (т.е. более высокое сродство) к O2, чем Hb, и поэтому клетки «высасывают» O2 из крови.
Электроны от цитохрома c последовательно
присоединяются сначала к ионам Fe3+ цитохромов a и a3, затем к ионам Cu2+ и, затем, попадают на O2.
При этом также происходит присоединение к кислороду H+ из матрикса => образуется
метаболическая вода:
- |
+ |
→ H2O |
½ O2 + 2 e+ 2H |
|
Таким способом в организме человека синтезируется ~ 400 мл метаболической воды в сутки.
Сумм. у-е 3 этапа:
2 цит. с (Fe2+) + ½ O2 + 2 H+ → 2 цит. c (Fe3+) + Н2O
! Работа IV комплекса цитохромоксидазы также сопровождается переносом H+ из матрикса в межмембранное пр-во.
Использование энергии ЦПЭ для синтеза АТФ.
Хемиосмотическая теория П. Митчелла, которая объясняет механизмы сопряжения процессов биологического окисления и фосфорилирования АДФ:
При движении от окисляемого субстрата к кислороду электроны теряют часть своей потенциальной энергии.
Комплексы (I, III и IV) внутренней мембраны митохондрий используют эту энергию электронов для переноса H+ из матрикса в межмембранное пространство митохондрий против градиента концентрации.
Т.е. комплексы ЦПЭ (I, III и IV) работают как протонные насосы, перекачивая H+ из матрикса в межмембранное пр-во митохондрий за счет энергии переноса электронов по ЦПЭ.
В результате возникает градиент концентрации H+ и градиент «+» заряда – протонный электрохимический потенциал (ΔμH+).
При накоплении в межмембранном пространстве достаточного кол-ва H+, происходит их присоединение к ферменту => изменяется заряд и конформация
фермента.
Это приводит к раскрытию протонного канала АТФсинтазы => H+ переносятся в матрикс по градиенту
концентрации.
Это приводит к активации поверхностной части фермента, кот. катализирует синтез АТФ:
АДФ + H3PO4 → АТФ + H2O
Было установлено, что при переносе электронов через поверхностную часть АТФ-синтазы происходит её вращение по кругу.
И каждый поворот на 120ο приводит к синтезу 1
молекулы АТФ.
! Окислительное фосфорилирование – это способ синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата с использованием энергии протонного электрохимического потенциала (ΔμH+), который
образуется за счет переноса электронов по ЦПЭ. Количество АТФ, которое образуется в результате сопряжения работы ЦПЭ и АТФ-синтазы, оценивается с помощью коэффициента фосфорилирования.
Коэффициент окислительного фосфорилирования (Р/О) показывает, какое количество неорганического фосфата затрачивается для фосфорилирования АДФ при использовании 1 атома кислорода на образование 1 молекулы воды.
! Коэффициент окислительного фосфорилирования численно равен количеству моль АТФ, синтезированных в результате окислительной реакции.
Энергия электронов и протонов, перенесенных комплексами ЦПЭ (I, III и IV) от субстратов NAD+- зависимых дегидрогеназ, достаточна для активации АТФ-синтазы и синтеза 3 моль АТФ в расчете на 1 моль дегидрируемого субстрата.
Т.е. для всех субстратов NAD+-зависимых дегидрогеназ Р/О ≤ 3.
Таким образом, дегидрирование 1 моль любого субстрата NAD+-зависимых дегидрогеназ сопряжено с синтезом 3 моль АТФ.
При дегидрировании веществ с участием FADзависимых дегидрогеназ происходит передача протонов и электронов на убихинон без участия комплекса I:
1)DH2 + E-FAD → D + E-FADH2
2)E-FADH2 + Q → E-FAD + QH2
Основной FAD-зависимой дегидрогеназой явл-ся Сукцинатдегидрогеназа.
Это поверхностный белок внутренней мембраны митохондрий (комплекс II).
Сукцинатдегидрогеназа катализирует превращение сукцината в фумарат, являющееся одной из реакций цикла Кребса:
Сукцинат + E-FAD → Фумарат + E-FADH2
В этом случае на пути электронов от субстрата на O2 только 2 участка переноса H+ в межмембранное пр-во митохондрий (комплексы III и IV)
Таким образом, энергия электронов и протонов, поступивших в ЦПЭ от субстратов FAD-зависимых дегидрогеназ, достаточна для активации АТФ-синтазы и синтеза 2 моль АТФ в расчете на 1 моль дегидрируемого субстрата.
Т.е. для субстратов FAD-зависимых дегидрогеназ (сукцинат, ацил-KoA, глицерол-3-фосфат): Р/О ≤ 2.
Витамин C (аскорбиновая к-та) способна восстанавливать ионы Fe3+ цитохрома c.
При этом Fe3+ принимает - и переходит в Fe2+. e
На пути электронов от цитохрома c на O2 1 участок переноса H+ в межмембранное пр-во (IV комплекс).
В этом случае Р/О ≤ 1.
Коэффициент Р/О показывает только теоретический максимум синтеза АТФ.
На самом деле, для синтеза АТФ используется ~ 4050% энергии ЦПЭ.
Остальная часть энергии выделяется в виде тепла, а также используется для других видов работ клеток:
Распределение энергии, выделяемой в
ходе работы ЦПЭ
Синтез АТФ |
Механическая работа |
~ 40-50% |
~ 20% |
Выработка тепла
> 30%
Итак, биологические функции ЦПЭ:
1)Использует энергию окисления субстратов для синтеза АТФ путём окислительного фосфорилирования;
2)Обеспечивает поддержание температуры тела человека.
Дыхательный контроль
Окисление субстратов и фосфорилирование АДФ в митохондриях прочно сопряжены.
Скорость использования АТФ регулирует скорость потока электронов в ЦПЭ.
Выполнение клеткой работы с затратой АТФ приводит к уменьшению концентрации АТФ. =>
Происходит накопление АДФ.
Это активирует окисление субстратов и поглощение O2 митохондриями клетки.
Таким образом, клетки реагируют на интенсивность
метаболизма и поддерживают соотношение АТФ/АДФ
на необходимом уровне.
Дыхательный контроль – это зависимость интенсивности поглощения кислорода митохондриями
от концентрации АДФ.
Ингибиторы ЦПЭ.
Ингибиторы ЦПЭ подавляют активность ферментных
комплексов (I, II, III и IV) => происходит замедление
или даже полное прекращение работы ЦПЭ =>
происходит замедление или полное прекращение
синтеза АТФ.
I комплекс: NADH-дегидрогеназа.
Ингибиторы: ротенон и барбитураты (амитал,
аминобарбитал, нембутал, веронал и др.)
II комплекс: FAD-зависимая сукцинатдегидрогеназа. Обратимый конкурентный ингибитор: малонат.
III комплекс: QH2-дегидрогеназа. Ингибитор: Антимицин A.
IV комплекс: Цитохромоксидаза.
Ингибиторы: цианид-ионы (CN–): KCN, HCN и др.;
угарный газ (CO), сероводород (H2S).
Антибиотик олигомицин не ингибирует саму ЦПЭ, но
подавляет окислительное фосфорилирование,
ингибируя АТФ-синтазу.
! При полном ингибировании in vitro любого из
ферментных комплексов, который располагается на
пути переноса электронов от дегидрируемого
субстрата на O2, работа ЦПЭ прекращается и АТФ не
синтезируется.
Примеры:
1) К суспензии митохондрий, где в качестве
окисляемого субстрата использовали малат, добавили амитал Na. Как при этом изменится синтез АТФ?
Т.к. амитал Na ингибирует NADH-дегидрогеназу, которая расположена на пути переноса электронов от малата на O2, то скорость ЦПЭ замедляется =>
замедляется (или прекращается) синтез АТФ.
2) Смесь: малат + амитал + сукцинат.
Р/О ≤ 2, т.к. в этом случае будет окисляться сукцинат,
для которого «не нужна» NADH-дегидрогеназа.
3) Смесь: сукцинат + малонат (избыток).
Синтез АТФ замедляется, т.к. малонат ингибирует сукцинатдегидрогеназу, которая располагается на пути электронов от сукцината на O2.
4) Смесь: сукцинат + малонат + изоцитрат.
Р/О ≤ 3, т.к. в этом случае будет окисляться изоцитрат,
для которого «не нужна» сукцинатдегидрогеназа.
5) Смесь: малат (или сукцинат) + антимицин A.
Синтез АТФ замедляется, т.к. антимицин A
ингибирует QH2-дегидрогеназу, которая располагается
на пути электронов от этих субстратов на O2.
6)Если к 5) смеси добавить витамин C, то Р/О ≤ 1,
так вит. C окисляет цитохром c (в переносе электронов не участвует QH2-дегидрогеназа).
7)CN– независимо от дегидрируемого субстрата
необратимо ингибируют ЦПЭ у человека. Они присоединяются к Fe3+ цитохромоксидазы и
полностью блокируют ЦПЭ.
(CN– – необратимый специфический ингибитор цитохромоксидазы).
Разобщение тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования.
Некоторые химические вещества (протонофоры) могут переносить H+ из межмембранного пространства митохондрии через внутреннюю мембрану в матрикс, минуя протонные каналы АТФ-синтазы => снижается (или даже полностью исчезает) ΔμH+ и замедляется
(прекращается) синтез АТФ.
Это явление называют разобщением тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования.