Обри ди Грей - Отменить старение

Замена пилы зубочисткой

Ценность дендримеров, как и универсального ножа, в их легкой адаптации

кразнообразным задачам. В экспериментах исследователи присоединяют

кним всевозможные нацеливающие молекулы и противораковые агенты. Один из наиболее остроумных вариантов такого подхода – “дендримеризация” борной нейтрон–захватной терапии (БНЗТ). Принцип такого лечения был впервые предложен более полувека назад, но применить его на практике до сих пор не удавалось.

БНЗТ несколько напоминает фотодинамическую терапию. Сначала пациенту вводят изотоп бора. Когда раковые клетки накапливают достаточные его количества, человека облучают низкоэнергетическим потоком нейтронов. И применяемый бор, и нейтроны сами по себе для нас практически безвредны. Однако когда ядра изотопа сталкиваются с потоком этих частиц, они поглощают их, становясь крайне нестабильными (радиоактивными), и начинают испускать жесткое альфа–излучение. Оно губит содержащие бор клетки и их ближайших соседей, но быстро теряет энергию и становится безопасным для остального организма. Результат – высокоизбирательное воздействие с минимальным побочным эффектом.

Естественно, самым сложный момент БНЗТ – введение бора исключительно в раковые клетки, чтобы после приема его изотопа нейтронное облучение не вредило здоровым тканям. С 1951 ученые пытались использовать такой метод против редкой, крайней агрессивной и плохо поддающейся лечению формы рака головного мозга, так называемой мультиформной глиобластомы. До сих пор достигнутые успехи были невелики и не позволяли превратить БНЗТ в стандартный метод лечения этой болезни.

Однако недавно в опытах на животных с мульформной глиобластомой дендримерное нацеливание бора позволило получить весьма многообещающие результаты. В головной мозг крыс имплантировали человеческие глиобластомные клетки с третьей мутантной версией рецептора эпидермального фактора роста (РЭФР), известной как РЭФРвIII, которая встречается в большинстве случаев такого рака. Затем дендримеры загружали бором, прикрепляли к ним нацеливающие агенты – моноклональные тела

кРЭФРвIII – и натравливали эти агрегаты на опухоли, т.е. просто вводили больным животным. Для более четкой демонстрации преимуществ нового метода его результаты сравнивали с состоянием целых трех контрольных групп: одна из них не получала никакого лечения, во второй крысам давали п–борфенилаланин (БФА), давший наилучшие результаты в прежних версиях БНЗТ, а в третьей – загруженные бором дендримеры в сочетании (но без химической связи) с БФА. В течение суток около 60% введенной дозы

Рис.4. Прицельный дендримерный метод существенно улучшает эффективность БНЗТ 31.

дендримеров, несущих БФА, связалось с мутантными рецепторами раковых клеток. Это обеспечило примерно втрое более высокую противоглиомную концентрацию активного вещества, чем при использовании одного БФА. Захват обоих лекарств нормальными тканями был пренебрежимо слабым. Вдохновленные таким удачным нацеливанием, исследователи стали ждать результатов собственно лечения.

Эти результаты были однозначными (см. рис.4). Не получавшие никакого лечения животные жили в среднем 26 дней. Использование БФА продлевало этот срок до 40 суток: существенное улучшение, но все же грустный прогноз. Крысы, получавшие бор, нацеленный денримерами, жили в среднем 70 дней, причем некоторые из них не умирали полгода и считались “выздоровевшими” (по аналогии с лечением, обеспечивающим пятилетнее выживание раковых людей, поскольку продолжительность жизни здоровых крыс около 30 месяцев). Если же животным вводили нагруженные бором дендримеры вместе с БФА, средняя продолжительность жизни достигла целых 85,5 дней. Это в три с лишним раза превысило показатель, наблюдавшийся без всякого лечения, и более чем вдвое – результат применения лучшего на сегодняшний день экспериментального варианта БНЗТ. Кроме того, 20% крыс, получавших БФА вместе с дендримерами, “выздоровели” в соответствии с указанным выше критерием.

На экспериментальных моделях были успешно испытаны дендримеры с различными нацеливающими и противораковыми агентами. Это первое поколение нанотехнологических лекарств четко продемонстрировало: у нас есть высокоэффективный и гибкий способ точечной бомбардировки

злокачественных клеток с известными поверхностными рецепторами, который в принципе применим и для уничтожения анергических Т–лимфо- цитов.

Доведение до самоубийства

В наши дни генная терапия широко применяется на подопытных мышах: с ее помощью тестируют аналогичные способы лечения людей, исследуют эффекты включения и выключения отдельных генов, моделируют человеческие болезни, модифицируя мышиные клетки для придания им большего сходства с нашими. Практическое использование генной терапии в обычных больницах, судя по результатам экспериментов, – всего лишь вопрос времени. Ее необходимость для лечения врожденных болезней и потенциальная польза при широком спектре других медицинских проблем, включая СПИД, ревматоидный артрит, травмы и реконструкция зубной ткани (список можно продолжить), – достаточные стимулы, чтобы продолжать фундаментальные и клинические исследования, которые довели бы до ума соответствующие методики.32

Один из вариантов такой генной терапии – встраивание в наши Т–клет- ки нового суицидального (апопотозного) механизма, включающегося с приобретением ими анергичности. Ученые уже научились вводить мышам (и другим лабораторным животным) гены, активируемые только в присутствии определенного фактора – антибиотика, ультрафиолета, сахара или даже повышенного уровня кальция. Фактически это позволяет нам произвольно включать и выключать специфические клеточные функции.

Введение в клетку экспрессируемых по желанию исследователей генов до сих пор было лишь мощным инструментом изучения их эффектов. Однако сейчас всерьез рассматривается применение этого подхода в медицинских целях. Если эти гены будет активироваться не внешними факторами, а определенным белком, внутренний синтез которого характерен для нежелательных нам клеток, фактически мы получим новый способ их избирательного уничтожения.

Как и в случае других, обсуждавшихся выше прицельных методик, первыми разработкой такого подхода занялись онкологи. Уже говорилось, что для роста раковой опухоли ее клеткам необходима способность восстанавливать свои теломеры. Иначе в ходе частых клеточных делений эти структуры быстро исчезнут – задолго до возникновения серьезной угрозы для нашего здоровья. Обычно такая способность возникает в результате активации отключенного гена, кодирующего фермент теломеразу. Этот ген присутствует во всех наших клетках, но рано или поздно инактивируется и уже никогда или большую часть времени никак себя не проявляет.

Следовательно, “заражая” клетки пациента “суицидальным геном”, который включался бы при повышении уровня теломеразы, мы снабжали бы их внутренним механизмом самоуничтожения. Это избавило бы нас от необходимости нацеливать на раковые клетки лекарства или иммунную систему. Образно говоря, враг, едва решившись на агрессию, сам накладывал бы на себя руки.

В принципе, создать “суицидальный ген”, разрушающий клетку при наличии в ней определенного белка, вполне возможно. Фактически это уже делалось у лабораторных животных с экспериментальными раковыми опухолями при помощи регулирующих апоптоз генов 33. Невосприимчивость к апоптозным сигналам анергических Т–лимфоцитов можно преодолеть, упорно бомбардируя их приказами покончить с собой. Однако одна из разрабатываемых сейчас альтернатив намного перспективнее. Она использует легче контролируемый – и, следовательно, более безопасный – способ введения в клетку гена, кодирующего белок, который сам по себе практически безвреден, но активирует так называемое “пролекарство”, т.е. неактивную форму смертельного медикамента.

Пролекарства – это вещества, требующие для своего терапевтического действия определенной формы метаболизации организмом, т.е. химического превращения в фармакологически активное соединение. Большинство пролекарств активируется ферментами нашей печени, выпускающей в кровоток их полезные нам производные. Другие больше похожи на так называемых “спящих агентов”: они незаметно распространяются по всему организму и “залегают на дно” до тех пор, пока не получат заранее оговоренного сигнала, который заставляет их действовать, т.е. прицельно поражать свои мишени.

Примерно так работают некоторые антивирусные средства, например ганцикловир (Цитовен/Цимевен), используемый против герпеса. Он останавливает размножение вируса, не давая тому пользоваться необходимой для этого системой репликации ДНК клетки–хозяина. Говоря более конкретно, лекарство подавляет действие вирусного варианта тимидинкиназы (ТК), участвующего в синтезе ДНК фермента.

ТК готовит азотистое основание тимин (одну из “букв” генетического кода) к встраиванию в цепочку ДНК путем фосфорилирования, т.е. присоединения к его производному, тимидину, фосфатной группы, отделяемой от молекулы АТФ – нашей “энергетической валюты”. Ганцикловир ведет себя как молекулярный двойник ценного сотрудника, внедренный для диверсии на вражеское производство. Благодаря структурному сходству с тимидином он обманывает вирусную ТК, которая по ошибке фосфорилирует лекарство.

После этого ганцикловир–фосфат продолжает свое черное дело, выда-

вая себя за тимидин–фосфат на сборочном конвейере ДНК и встраиваясь в ее синтезируемую цепочку. Задача внедренного агента выполнена: оказавшись в составе растущей молекулы, он останавливает ее дальнейшее удлинение. В результате вирус не может копировать свою ДНК, а значит размножаться. Его атака на организм прекращается. Иммунной системе остается лишь обнаружить и уничтожить немногочисленные клетки, в которых он прячется, никак не влияя на наше здоровье.

Если бы ганцикловир умел так же ловко обманывать не только вирусный, но и наш собственный, человеческий вариант ТК, его можно было бы с успехом использовать как противораковое средство. Злокачественные клетки становятся опасными за счет своего быстрого размножения. Значит, нарушив необходимый для клеточного деления синтез ДНК, можно эту опасность ликвидировать. Естественно, такой подход чреват серьезнейшими побочными эффектами, поскольку он одновременно нарушал бы необходимое организму размножение его нормальных клеток. В случае рака с таким ущербом еще можно было бы смириться – пациент оправился бы от него после отмены укротившего опухоль лекарства. Однако при борьбе с вирусом того же герпеса этот вариант абсолютно неприемлем.

В любом случае ганцикловиру редко удается провести человеческую ТК, поэтому он подавляет в основном репликацию вируса, хотя и несколько ухудшает у пациента регенерацию клеток крови и выработку сперматозоидов. Однако недавно группа японских и американских ученых продемонстрировала, что систему вирусная ТК/ганцикловир в принципе можно использовать для подавления рака. Надо лишь научиться с помощью генной терапии вводить этот фермент во все клетки пациента, но включать его только в злокачественных.

Как уже говорилось, одно из характерных отличий раковых клеток от нормальных, которое можно было бы использовать для избирательной активации вирусной ТК – присутствие активной теломеразы. Присоединив ген этой ТК к “пусковому механизму” (промотору), включающему транскрипцию только при наличии теломеразы, мы заставили бы вирусный фермент останавливать деление злокачественных клеток, тогда как почти во всех остальных он вообще не синтезировался бы.

Описанная схема напоминает биотехнологический эквивалент одного из хитроумных многоступенчатых приспособлений, которые используются в настольной игре “мышеловка”. Ученые ставят свою “ловушку”, сначала засевая все клетки пациента копиями гена, кодирующего вирусную ТК, в совокупности с реагирующим на теломеразу промотором. После этого пациент глотает таблетки ганцикловира, который опять же неизбирательно проникает во все его клетки.

Рисунок 5. Схема использования ганцикловира и вирусной тимидинкиназы для борьбы с раковыми клетками млекопитающих.

В подавляющем большинстве из них лекарство никак себя не проявляет, поскольку почти по всему человеческому организму теломераза отсутствует. Однако, когда ганцикловир попадает в раковую клетку, ловушка срабатывает. Присутствующая там теломераза запускает образование вирусной ТК; та фосфорилирует ганцикловир, делая его пригодным для присоединения к растущей копии клеточной ДНК; синтезирующий ее фермент (ДНК–полимераза), принимая ганцикловир–фосфат за тимидин–фосфат (нормальную “букву” генетического кода), встраивает лекарство в незавершенную цепочку ДНК. В этот момент пора кричать: “Мышеловка!”, поскольку дальнейший синтез ДНК становится невозможным, клеточное деление – тоже, и рост раковой опухоли прекращается (см. Рисунок 5).

Схема сложная, но она действовала в пробирочных экспериментах на раковые клетки печени, почек, поджелудочной и щитовидной желез. Более того, была доказана ее практическая безопасность для нормальных клеток крысиной щитовидки и человеческой кожи 34. В результате ученые перешли к следующему этапу ее реализации – клиническому испытанию на лабораторных животных.

Сначала они изготовили две партии гена вирусной ТК: у одной промотор активировался теломеразой, а у другой должен был “включаться” как в раковых, так и в нормальных клетках. Потом они ввели такие молекулярные конструкции в вирусы того же семейства, что и возбудители обычной простуды, позволив им буквально заразить животных генетическими “ловушками”. Первыми получили их здоровые особи – для проверки потенциальных побочных эффектов. Как и ожидалось, вирусная ТК, синтезируемая с участием неизбирательного промотора, после инъекции ганцикловира привела к тяжелому поражению печени. Если же ее ген был связан с промотором, активируемым теломеразой, отрицательных последствий практически не наблюдалось – впрочем, как и положительных, поскольку раковые клетки, экспрессирующие теломеразу, тоже отсутствовали.

После этого ученые перешли к следующей стадии испытаний: тестированию этой терапии на животных с имплантированными клетками человеческой карциномы щитовидки. Когда им ввели ген вирусной ТК с промотором, активация которого не зависит от присутствия теломеразы, рост опухоли полностью остановился, но, как и ожидалось, это одновременно не дало размножаться нормальным клеткам, что привело к тяжелому поражению печени.

Однако при избирательном нацеливании вирусной ТК на раковые клетки с помощью зависимого от теломеразы промотора ганцикловир прекратил рост опухоли так же эффективно, как и в предыдущем случае, но без наблюдавшегося при этом токсичного эффекта. Безопасность такого высокоселективного подхода становится еще более убедительной, если вспомнить, что вирусную ТК можно включать и выключать, соответственно вводя ганцикловир и прекращая его применение.

Знать врага в лицо

Очевидно, в поисках новых способов избирательного (т.е. безвредного для организма в целом) нацеливания на раковые клетки и их уничтожения биологи бывают такими же изобретательными, как и конструкторские бюро оружейных компаний. Следовательно, вполне можно ожидать, что уже применяемые или разрабатываемые противораковые методы удастся адаптировать для борьбы с анергическими Т–лимфоцитами. В данном случае враг, можно сказать, ходит с нарисованной прямо на груди мишенью. Аномальные рецепторные свойства, лишающие эти клетки способности распознавать целевые антигены (отсутствие CD28) и размножаться в ответ на инфекцию (присутствие одновременно KLRG1 и CD57), а, возможно, и некоторые другие метки (например, пониженный уровень CD154, связанный с

недостаточной поддержкой старыми Т–лимфоцитами развития В–клеток) позволяют ученым легко распознавать этих вредителей и, следовательно, пригодны для нацеливания на них разрушающих агентов.

Обрушить гнев иммунной системы на ее угнетателей – цель заманчивая, однако иммунизация (и активная, и пассивная) против анергических лимфоцитов связана с существенными проблемами. Прежде всего, их самая характерная антигенная особенность – отсутствие поверхностного белка CD28. Можно, конечно, использовать для нацеливания сочетание рецепторов KLRG1 и CD57, но еще не ясно, все ли нежелательные лимфоциты экспрессируют эти два белка и не несут ли такие же метки другие, нужные нам, клетки. Правда, иммунологи уже идентифицируют анергические лимфоциты с помощью наборов антител, однако применять их для иммунизации затруднительно. Не стоит также забывать, что проблему придется решать в условиях слабого действия вакцинаций, т.е. “уколы” против анергических Т–клеток, возможно, хорошо помогут только сравнительно “молодым” иммунологически индивидам. Следовательно, хотя такой подход и перспективен в отношении многих типов токсичных клеток, в случае CD8–клонов его достаточная эффективность вызывает сомнения.

Тем не менее, у нас в запасе остается еще много вариантов. Простейшим представляется применение дендримеров, позволяющих нацеливаться на клетки с помощью множества идентификационных меток, а заодно и воздействовать на мишени различными ядами – от явных токсинов до бора (при использовании БНЗТ).

В то время как вакцинация против анергических Т–лимфоцитов представляется проблематичной, существует и другой путь использования иммунной системы в качестве пятой колонны, помогающей восстановить власть правительства в изгнании. Если помните, анергические CD8–лим- фоциты становятся проблемой, когда перестают подчиняться апоптозным приказам, ведущим в норме к демобилизации этих клеток после отражения атаки патогена, против которого они развертывались. Их строптивость объясняется выработкой избыточных количеств белка bcl–2: его высокий уровень блокирует апоптозные сигналы.

Это подразумевает возможность снятия такой блокады путем введения в не желающие умирать клетки “антисмысловой РНК” – отрезков генетического материала, комплементарных к транскрибируемым с ДНК матрицам для синтеза bcl, а в результате их инактивирующих. В результате выработка bcl–2 как минимум ослабляется. Когда его уровень падает до нормы, а то и практически до нуля, анергические CD8–клетки снова начинают “слышать” приказы самоуничтожиться – и подчиняться им.

Приведет ли очистка “иммунологического пространства” от анергических Т–клеток к полному омоложению иммунной системы? Не могу утверж-

дать этого с уверенностью, поскольку на практике такой вариант еще не проверялся, а наш организм – невероятно сложная машина, у которой известны еще далеко не все части, не говоря уже об их функциях и взаимодействиях. Проведенные на сегодняшний день исследования четко указывают на достаточно сильное прямое и косвенное иммуносупрессивное действие этих лимфоцитов. Следовательно, избавление от них должно существенно усилить Т–клеточный иммунитет и, вполне вероятно, улучшить работу других, зависящих от Т–клеток компонентов иммунной системы. Однако насколько выраженными будут эти положительные эффекты, мы узнаем, только когда изучим их непосредственно.

Сейчас же мне ясно, что ликвидация анергических Т–клонов не отразится как минимум на одном аспекте иммунологического старения – возрастной инволюции тимуса. Тимус, или вилочковая железа, находится непосредственно за грудиной. Здесь созревают, превращаясь в Т–лимфоциты, иммунные клетки, вырабатываемые костным мозгом. С возрастом ткани тимуса постепенно отмирают, его размеры сокращаются, и он дает нам все меньше наивных Т–лимфоцитов. Естественно, это ограничивает возможности организма реагировать на новые угрозы.

В принципе, существует достаточно очевидный способ решения этой проблемы: стволовоклеточная терапия – весьма перспективная уже в ближайшем будущем методика, на которой я остановлюсь в следующей главе (см. там врезку “Реконструкция тимуса”) 35. Речь идет о превращении недифференцированных эмбриональных (стволовых) клеток в специализированные клетки практически любых тканей, что позволило бы лечить, восстанавливать и омолаживать различные органы. Эти проблемы уже достаточно быстро решаются в экспериментах со всевозможными тканями по всему нашему телу, так что есть веский повод для оптимизма.

А сейчас я завершаю обсуждение иммунных зомби – пора рассмотреть и другие типы перегружающих организм клеток.

Смертельная битва с жирным брюхом

Второй тип потенциально вредных клеток, от избытка которых желательно избавиться, – адипоциты, образующие жировую ткань, особенно так называемый висцеральный (внутренностный) жир, покрывающий внутренние органы – в отличие от подкожного жира, который откладывается, можно сказать, снаружи. Согласно общепризнанному мнению, с возрастом происходит “естественное” повышение резистентности к гормону инсулину, отвечающему за поступление аминокислот и углеводов из крови в жировые и мышечные клетки. Иными словами, он все хуже справляется со своими за-

дачами. Это ведет к целому спектру опасных метаболических изменений, наиболее выраженных при развитии сахарного диабета 2–го (“взрослого”) типа. Кроме того, широко распространено мнение о том, что с возрастом в нашем организме “естественным образом” распространяются всевозможные хронические воспаления – тело как бы медленно сгорает изнутри из–за избыточной выработки провоспалительных сигнальных молекул.

Если мы потребляем с пищей больше калорий, чем расходуем, они не выделяются из организма, а накапливаются в нем. Это не недосмотр нашей эволюции, а одна из стратегий выживания. До сравнительно недавнего (по эволюционным меркам) времени люди достаточно часто сталкивались с недостатком пищи, когда запасенное впрок топливо могло спасти их от голодной смерти. Если организм не сталкивается с такими проблемами и не подвергается специальным нагрузкам (типа силовых упражнений), которые способствуют накоплению активно “сжигающей” калории мышечной ткани или росту костей, он использует простейший способ запасания излишков топлива, превращая его в энергоемкий жир. Поскольку сейчас в развитых странах голод практически отсутствует, а физические нагрузки – вещь почти исключительно добровольная и не слишком распространенная, жировая ткань не расходуется, а постепенно накапливается с возрастом. В результате объем ее запасов отличает пожилых людей от здоровой молодежи, что позволяет в рамках моего биоинженерного подхода считать эту разницу “возрастной патологией”, даже если она и не является аномалией с чисто теоретической точки зрения.

Давно известна связь такой патологии, достигшей масштабов лишнего веса и тем более ожирения, с повышенным риском диабета, ишемической болезни и других недугов, однако каков здесь причинно–следственный механизм, выяснилось только недавно. Возможно, вы слышали, что влияние жира на здоровье зависит от его локализации в теле. “Яблочная” конституция (с накоплением жира в районе поясницы, например в случае “пивного живота”) предрасполагает к диабету и ишемической болезни гораздо сильнее, чем “грушевидная” (с основной массой жира в бедрах и ягодицах) – пусть неэстетичная, но для здоровья явно менее опасная. Биомедицинская основа такой разницы связана с относительными количествами в теле внутренностного и подкожного жира. Первый накапливается главным образом в районе поясницы, поскольку окружает органы брюшной полости, в частности печень и почки. И напротив, подкожный жир распределяется по телу гораздо равномернее, хотя в некоторых местах (например, ягодицах) его, разумеется, больше, чем в прочих.

Недавние исследования показали, что возрастное повышение инсулинорезистентности почти всегда, а возрастное усиление провоспалительной