ЧастьIiпцр амплификация

Что такое ПЦР

ПЦР – это технология, которая позволяет сделать множество копий ДНК, это один из краеугольных камней для революционного развития молекулярной генетики до пришествия ПЦР сделать достаточное количество копий ДНК для определения последовательности было нудным процессом. Сейчас ПЦР делает получение копий ДНК из маленьких уникальных образцов процессом позволяющим достичь быстрого результата. Например это делает ДНК отпечатков пальцев широкораспространенным не только в судебной науке для выявления потенциальных преступников, но также для использования добропорядочных биологов чтобы установить контроль над популяциями диких птиц, для наблюдения какой вид поведения приведет к успеху в брачных танцах.

В нормальных клетках двойная цепочка ДНК расщепляется с помощью энзимов, для начала нового процесса репликации. В ПЦР одна цепочка ДНК получается с помощью нагревания фрагмента хромосомы до 95С с последующим охлаждением пока праймеры присоеденятся к изначальным цепочкам и ДНК полимераза отщипит и скопирует каждую цепь. При повторном нагревании и охлаждении миллионы а также биллионы копий ДНК могут быть получены всего за несколько часов. Важным открытием было обнаружение хемотропных бактерий живущих в гидротермических впадинах океанского дна. Эти создания живут в пещерах при температуре выше 100С соответственно их ДНК-полимеразы функционируют при таких температурах, которые денатурировали бы ДНК-полимеразы обычных существ. Полимераты ДНК этих бактерий дали возможность развить автоматический термостат без которого былобы необходимо добавлять новые полимеразы каждый цикл. Чтобы получить только желаемую позицию ДНК эта лаборатория использует полинуклеатидные праймеры, которые специализируются на присоединении к частям 16SрДНК гена.

Чтобы приготовить ПЦР мы должны добавить в основной ПЦР раствор к нашему образцу ДНК. В основном ПЦР растворе (пробирка с красной крышкой) смешивают воду, буферный раствор и корректируют рН до оптимальной для постановки реакции; в избыточном количестве четыре нуклеотиды, праймеры, которые связывают 16SрДНК части и инициируют репликацию ДНК (что такое праймеры?); и термостабильную ДНК-полимеразу. В это же время мы приготовим отрицательный и положительный контроли.

Праймеры – маленькие кусочки ДНК, которые связывают специфические последовательности, в данном случае последовательность 16SрРНК гена. В этой лаборатории используются два праймера: 27Fи 1525R, связывающие противоположные концы гена в любой цепочке ДНК. В то время как праймеры связывают, ДНК полимераза растягивает ДНК от 5` конца к 3` концу. Праймеры подбираются таким образом, что образуются две новые копии, они перекрывают в этой области все совпадения (смотри анимированную иллюстрацию). Праймеры универсальны, их значение в связывании и копировании, таким образом 16SрРНК гена, всех видов бактерий (исключая большинство нетипичных). Потому как последовательность которую связывают праймеры крайне точно повторяет последовательность присущую всем видам бактерий.

Вы можете спросить, если они схожи, то как мы можем использовать это для идентификации и дифференциации вида бактерии? Что является основным диферринциальным показателем? Ответ в тех частях гена, котроые принадлежат лишь данному виду бактерии (то есть которые сохранились) те другие, которые не типичны для большинства бактерий. Универсальные праймеры связывают большинство консервированных зон гена, что дает таким образом использовать копии ДНК для определения вида бактерии. Вариабельные зоны, которые распологаются между видами используются для определения.

В то же время для теста реакции, мы должны приготовить отрицательную и положительную контрольные пробы. Вместо образца ДНК положительный контроль включает положительно реагирующую ДНК (раствор 16SрДНК в пробирке с зеленой крышкой) в то время как отрицательный контроль включает в себя дистиллированную воду. Обе реакции ставятся с основным ПЦР раствором.