2. Ветеринарно-санитарная оценка
Ветеринарно-санитарная оценка белковых кормовых продуктов микробиологического синтеза включает следующие этапы.
1. Анализ состава ингредиентов продукта и, прежде всего, определение содержания в нем небелковых соединений азота, как разницы между содержанием сырого протеина, установленному по Кьельдалю, и белка, определяемого по Барштейну.
2. Определение токсичности продуктов микробиологического синтеза пробой на лабораторных животных и культуре Tetrachymenа priformis.
3. Определение содержания фтора в продуктах микробиологического синтеза.
4. Определение общей бактериальной обсемененности.
5. Определение наличия бактерий сальмонеллезной группы.
2.1. Анализ состава белковых ингредиентов продукта. В качественном удостоверении на продукт должны быть указаны показатели содержания сырого протеина и белка, выраженные в процентах на абсолютно сухое вещество. Если эти показатели не обозначены или обозначены частично (только сырой протеин или только истинный белок), желательно провести анализ уровня сырого протеина и истинного белка. Если содержание небелкового азота составляет более 10 % по массе продукта, есть основание предполагать, что продукт некачественный и может послужить причиной заболевания, гибели или снижения продуктивности животных. В этом случае продукт нужно проверить на токсичность на лабораторных животных.
2.2. Определение токсичности на белых мышах. Для этого пробу кормовых дрожжей (паприна, эприна) массой 100 г помещают в колбу с притертой пробкой, заливают 200 мл ацетона и экстрагируют встряхиванием на шуттель-аппарате в течение 2–3 ч, а при отсутствии аппарата пробу заливают ацетоном и оставляют при комнатной температуре на 24 ч, периодически встряхивая колбу. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в выпаривательные чашки, добавляют в них по 2,5 мл растительного масла, выпаривают ацетон на водяной бане при температуре 45–50°С в вытяжном шкафу до исчезновения запаха. При получении после выпаривания ацетона неразмешивающегося осадка к нему следует добавить 0,5–1,0 мл теплой дистиллированной воды и подвергнуть полученную массу тщательному размешиванию до однородного состояния.
Для определения токсичности берут пять белых мышей живой массой 20–25 г, выдерживают без корма в течение 4–5 ч, после чего с помощью шприца с тупой иглой (3–4 см длины) через рот в желудок однократно вводят 0,5 мл экстракта. За мышами наблюдают в течение трех суток, не ограничивая их в кормлении и поении. В случае отсутствия падежа мышей их убивают (эфиром) и вскрывают. Контрольным мышам в том же объеме вводят растительное масло.
Гибель всех или хотя бы одной мыши и обнаружение на вскрытии воспаления желудочно-кишечного тракта, метеоризма, дегенерации печени, кровоизлияний во внутренних органах указывают на токсичность исследованных кормовых средств. При отсутствии гибели мышей, но при обнаружении патологоанатомических изменений во внутренних органах, а также при развитии клинических признаков интоксикации (угнетенное состояние, слабая подвижность, плохая поедаемость корма, выраженный метеоризм) проводят повторное исследование.
Корма микробиологического синтеза, не вызвавшие клинических признаков интоксикации, гибели животных или же патологоанатомических изменений, считают нетоксичными и применяют в соответствии с существующими нормами. Токсичный корм использованию не подлежит.
2.3. Определение токсичности с применением тест-культуры Tetrahimenae pyriformis. Среду УСД (углеводно-солевую дрожжевую) для определения токсичности составляют по следующей прописи: D-глюкоза или глюкоза кристаллическая гидратная – 1,5 г; экстракт дрожжевой – 0,1; соль морская для ванн – 0,1 г. Среду готовят в мерном стакане на 100 мл; объем доводят до метки дистиллированной водой, устанавливают рН 7,1–7,2, затем среду разливают в конические колбы емкостью 10 мл, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве 15–20 мин.
Среду триптонную или пептонную (для поддержания инокулята инфузорий) составляют по следующей рецептуре: пептон сухой ферментативный для бактериологических целей – 2,0 г; D-глюкоза, или глюкоза гидратная – 0,5; экстракт дрожжевой – 0,1; соль морская - 0,1 г.
Среду готовят в мерном стакане на 100 мл; объем доводят до метки дистиллированной водой, устанавливают рН 7,1–7,2, затем среду разливают в конические колбы на 10 мл; закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве 15–20 мин; хранят в течение 1 мес при температуре 4 °С.
Культивирование инфузорий проводят путем пересева 0,2 мл среды с культурой на свежую триптонную или пептонную среду. Пересев проводят каждые 7 дн. Раз в месяц ставят бактериологический контроль стерильности среды путем посева на мясопептонный агар.
Для приготовления фосфатного буфера рН 7,4 в мерную колбу емкостью 200 мл помещают 81 мл 0,2 М раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного и 19 мл 0,1 М раствора натрия фосфорнокислого однозамещенного, объем в колбе доводят до 200 мл дистиллированной водой.
Массу навесок продукта (М), соответствующую заданным количествам (концентрациям) азота (3, 6, 10, 15 и 20 мг) рассчитывают по формуле:
А×100
М = ------------- , где
N
А – заданные количества (концентрации) азота в навеске продукта, мг;
N – содержание азота в продукте, %;
100 – коэффициент пересчета азота в 100 г продукта.
Навески продукта, соответствующие содержанию в них азота 3, 6, 10, 15 и 20 мг, переносят в конические колбы со средой УСД. Проверяют рН среды, который не должен резко меняться. Если рН снижается до 5 и ниже, вместо дистиллированной воды применяют фосфатный буфер рН 7,4. Затем засевают 0,2 мл инокулята 3–4-суточной культуры инфузорий и инкубируют в термостате при температуре 24–26 °С в течение 6–72 ч. Для лучшей аэрации колбы встряхивают 2–3 раза в сутки. В качестве контроля за состоянием культуры используют казеин в заданных концентрациях азота (3, 6, 10, 15 и 20 мг).
Культуру инфузорий в исследуемых пробах просматривают в капле на предметном стекле (каплю берут стеклянной палочкой или пастеровской пипеткой) под микроскопом в 5–6 нолях зрения через 72ч.
В случае гибели инфузорий в течение учетного времени хотя бы в одной из концентраций или наличия, единичных (до пяти клеток) в поле зрения при одновременном снижении активности тест-культуры в двух последних концентрациях продукт считается токсичным. При большом количестве анализируемых проб допускается использование микрометода при 10-кратном уменьшении питательной среды, навески и количестве засеваемой культуры. Для исследования берут флакончики из-под антибиотиков с резиновыми пробками, имеющими боковой срез для доступа воздуха, или доски для постановки реакции гемагглютинации.
2.4. Определение содержания фтора. Метод основан на изменении электрического потенциала в пробах кормовых дрожжей при измерении его посредством селективного фторидного электрода.
Для приготовления раствора хлорной кислоты 14 мл концентрированной хлорной кислоты цилиндром емкостью 25 мл переносят в мерную колбу на 1 л, доливают дистиллированную воду до метки и, добавляя по каплям хлорную кислоту, доводят рН раствора до 1,0.
Раствор лимоннокислого натрия готовят следующим образом. В стакан емкостью 1 л отвешивают 300 г соли, добавляют 10 мл раствора соляной кислоты в соотношении 1:1 и 600 мл дистиллированной воды. После растворения соли раствор переносят в мерную колбу на 1 л, доводят до метки дистиллированной водой и, добавляя по каплям раствор хлорной кислоты (соотношение 1:1), доводят рН раствора до 6,5.
Готовят стандартные растворы фтористого натрия. Раствор А фтористого натрия (0,1 М): в стакан емкостью 100 мл отвешивают 100 г соли, приливают 100 мл раствора лимоннокислого натрия и полученный раствор количественно переносят раствором хлорной кислоты с рН 1 в мерную колбу на 500 мл, доводят объем до метки раствором хлорной кислоты и смесь перемешивают, этот раствор имеет рН 1,0. Раствор хранят в полиэтиленовой посуде с плотно закрытой пробкой, срок хранения – 6 мес. Раствор фтористого натрия 0,01 М: из раствора пипеткой отбирают 10 мл, переносят в мерную колбу емкостью 100 мл, приливают 20 мл раствора лимоннокислого натрия, доводят объем колбы до метки раствором хлорной кислоты, смесь перемешивают. pН такого раствора равен 2. Затем последовательно таким же способом готовят растворы фтористого натрия концентрации 0,001 М (pН 3), 0,0001 М (pН 4), 0,00001 М (pН5). Во всех колбах величина рН должна быть равна 1,0. Растворы фтористого натрия концентрации 0,01, 0,001, 0,0001 и 0,00001 М готовят в день проведения анализа.
Новый фторидный электрод следует предварительно выдержать в 0,001 М растворе фтористого натрия. Если с электродом работают ежедневно, его хранят, погрузив в 0,0001 М раствор фтористого натрия. При длительных перерывах в работе электрод хранят в сухом состоянии.
Построение градуировочного графика заключается в следующем. В полиэтиленовые мензурки емкостью 30 мл наливают по 20 мл каждого стандартного раствора, погружают на дне мензурки магнит и в порядке возрастаний концентрации фтористого натрия в растворе устанавливают мензурки на магнитную мешалку, помещают в раствор электроды, включают перемешивание и через 8 мин делают замер величины потенциала. После каждого замера величины потенциала электроды необходимо тщательно промыть большим количеством дистиллированной воды до установления исходного значения водного потенциала, а затем осушить фильтровальной бумагой. При выполнении измерений нужно следить за тем, чтобы на поверхности мембраны фторидного электрода не скапливались пузырьки воздуха. На основании результатов измерений строят калибровочный график на бумаге с полулогарифмической сеткой, откладывая по оси абсцисс концентрацию фтора (М), на оси ординат – величину потенциала (мВ). При построении градуировочного графика проверяют правильность работы фторидного электрода – по крутизне градуировочной кривой. При измерении потенциалов рабочих стандартных растворов потенциал должен изменяться от раствора к раствору на величину 56±3 мВ. Если такая зависимость в изменении потенциала не соблюдается, то фторидный электрод следует регенерировать вымачиванием в 0,001 М растворе фтористого натрия в течение суток, а затем тщательно отмыть дистиллированной водой.
Пробу массой 10–15 г тщательно растирают в фарфоровой ступке до пудрообразного состояния и хранят в пластмассовых чашках Петри. Затем в две полиэтиленовые мензурки емкостью 30 мл отвешивают от 0,05 до 0,3 г продукта из такого расчета, чтобы количество фтора в навеске находилось в пределах от 1 до 50 мкг. Пипеткой приливают по 15 мл раствора хлорной кислоты (рН 1), предварительно нагретого до 50°С, ставят на магнитную мешалку с подогревом до 50 °С, включают перемешивание и выдерживают в течение 15 мин. Полученную суспензию охлаждают до комнатной температуры, после чего приливают по 3 мл лимоннокислого натрия. Далее, в порядке возрастания навесок, в полученную суспензию погружают электроды, помещают на магнитную мешалку и через 3 мин замеряют потенциал. Одновременно проводят холостой опыт без продукта. Для этого в полиэтиленовую мензурку наливают 15 мл раствора хлорной кислоты и выдерживают при температуре нагрева до 50 °С на магнитной мешалке в течение 15 мин. Охлаждают до комнатной температуры, приливают 3 мл раствора лимоннокислого натрия, погружают в раствор электроды и через 3 мин измеряют потенциал. После каждого измерения электроды тщательно обмывают дистиллированной водой.
Содержание фтора (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:
А×19×18×1000
Ч = ------------------- , где
М
где А – концентрация фтора в суспензии продукта, найденная по градуировочному графику, г-моль/мл;
19 – грамм-эквивалент фтора;
18 – объем анализируемой суспензии, равный объему хлорной кислоты и лимоннокислого натрия, мл;
М – масса навески продукта, г.
Содержание фтора в кормах микробиологического синтеза может колебаться в значительных пределах - от 10 до 500 мг/кг.
Определение общей бактериальной обсемененности кормов микробиологического синтеза и бактерий сальмонеллезной группы проводят так же, как и при исследовании кормов животного происхождения.