7. Выращивание растительных тканей и клеток in vitro. Применение методов биотехнологии в фармакогнозии.

Промышленное применение культур тканей в качестве лекарственно­го сырья предполагает использование высокопродуктивных и стабиль­ных клонов. Известно, что культивирование клеток in vitro может сопровождаться значительным генетическим разнообразием. Речь идет о так называемой сомаклональной изменчивости, которая возникает при длительном культивировании каллуса. Сомаклональные варианты, сохраняя основные свойства прототипа, часто значительно отличаются от него устойчивостью к вирусам, болезням, экологическим стрессам, а иногда несколько измененной биосинтетической способностью и более высокой продуктивностью − т.е. могут затрагивать хозяйственно ценные признаки. На изменчивости клеток в культуре in vitro осно­вана селекция штаммов, обеспечивающая большой выход ценных продук­тов метаболизма.

Для увеличения спектра изменчивости используют мутагенез (обработка мутагенными веществами), а также селективные условия культивирования клеток. Спонтанно возникшие или индуцированные мутанты в популяции отбираются на устойчивость к созданным жестким условиям: высоким концентрациям солей, экстремальным температурам, гербицидам, токсинам и др. В результате многих экспериментов удается отобрать устойчивые линии и получить растения-регенеранты из стабильной клеточной линии.

Успех в селекции в значительной мере зависит от внедрения ме­тодов количественной оценки селекционного материала. Так, для количественной оценки содержания аймалина в культуре тка­ни раувольфии змеиной разработан быстрый и несложный экспресс-метод, основанный на сравнении интенсивности окраски пятен сока каллусных культур, нанесенных на фильтровальную бумагу и обрабо­танных цветным реактивом, со шкалой стандартов. Метод позволяет исключить заведомо неперспективные варианты и сократить количест­во культур, подлежащих окончательной проверке.

Высокопродуктивные клоны культуры ткани та­бака были селектированы благодаря полуколичественному методу оп­ределения алкалоидов с реактивом Драгендорфа. Ярко-голубая флуо­ресценция серпентина в УФ-свете (λ_max= 365 нм) была использова­на в селекции высокоалкалоидных штаммов суспензионной культуры катарантуса розового. Селекция штаммов культур тканей с высоким содержанием изохинолиновых, акридоновых и индольных алкалоидов также основана на измерении флуоресценции этих алкалоидов.

Успешным оказался также способ селекции, основанный на отборе окрашенных участков культуры ткани. Известно, что окраска тканей растений является наследственным признаком, связанным с их химическим со­ставом. Связь между окраской тканей и их химическим составом была использована в селекции культур тканей, высокопродуктивных по содержанию антоцианидинов. После 12 пассажей содержание антоцианидинов увеличилось в 3 раза. Селекция промышленных штаммов воробейника краснокорневого была осуществлена путем отбора и пе­ресадок красных участков каллуса. Высокоалкалоидные культуры ткани барбариса − продуцента берберина также были получены в результате клонирования и отбора желтых участков каллуса.

Важным условием биотехнологического использования культур тка­ней является их стабильность, гарантирующая стандартность лекар­ственного сырья. Такие культуры-суперпродуценты, как Аmmi visnaga (L.) Lam., Rauwolfia serpentina Benth., Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc., на протяжении многих лет зарекомендовали себя как устойчивые. Но для многих тканевых культур, например Catharanthus roseus (L.) G. Donf., единственным путем сохране­ния высокой продуктивности является регулярный поддерживающий от­бор, их нестабильность − серьезное препятствие к промышленному использованию.

Клеточная селекция − одна из наиболее перспективных клеточных технологий для создания сортов не только важнейших сельскохозяйственных, но и лекарственных растений. В настоящее время с большим ускорением развиваются исследовательские работы по созданию высокопродуктивных штаммов и растений-регенерантов методам и гибридизации соматических (неполовых) клеток путем слияния протопластов и генной инженерии.

Хотя методы соматической гибридизации и генной инженерии пока еще не получили промышленного развития, однако ученые считают, что за ними будущее и генная инженерия станет естественным приемом при создании новых нужных человеку лекарственных растений – продуцентов фармакологически ценных веществ.

В зависимости от условий клетки в культуре in vitro могут делиться анархически, образуя неорганизованную каллусную массу, либо менять программу своего поведения и делиться организованно с образованием зачатков корней, стеблей, зародышей. Из этих зачатков растений в культуре in vitro затем можно регенерировать растения.

Легче всего вызвать морфогенез (образование органов и тканей) и регенерацию растения, используя зародыши и почки, а также стеблевые меристемы, но даже из зародышей, изолированных на ранних стадиях развития, или апикальных меристем стебля очень маленьких размеров для получения растений нужны дополнительные условия, например, очень богатые питательные среды. Обычно в каждом случае разрабатывают условия культивирования и соответствующие питательные среды.

Стеблевая верхушечная меристема, как правило, свободна от вирусной инфекции, микоплазм и возбудителей других инфекций, поэтому культивирование апикальных меристем, а затем быстрое клональное размножение здоровых растений − основа технологии получения безвирусного посадочного материала растений: плодовых, ягодных, декоративных, лекарственных.

Велико значение культуры тканей высших растений для быстрого клонального микроразмножения растений, используя клоны генетически идентичных клеток. Этот процесс “миниатюрен” в сравнении с традиционной техникой вегетативного размножения черенками, отводками, усами, прививками. Он идет быстро и с высоким выходом посадочного материала: от материнской клетки за год можно получить 10⁵-10⁶ растений.

Растения-регенеранты затем адаптируются к почвенным условиям и переводятся в обычную агрокультуру. Сейчас – это основное направление в биотехнологии сельскохозяйственных и ЛР.

Технологии клонального микроразмножения − важное дополнение к традиционной селекции растений. Можно быстро размножить уникальный генотип или новый сорт, что ускоряет его практическое использование. В настоящее время найдены условия размножения более 500 экономически важных или исчезающих видов дикорастущих растений. Многие из них размножаются уже в производственных условиях. Что касается ЛР, технологии микроклонального размножения разработаны в отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений АН России для мандрагоры туркменской, аристолохии маньчжурской, женьшеня, в Санкт-Петербургской химико-фармацевтической акдемии − для ряда видов раувольфии, в ВИЛАРе − для стефании гладкой. Аналогичные работы проводятся в отделе биохимии и биотехнологии растений ЦБС НАН Беларуси.

Таким образом, основой биотехнологического использования культур тканей рас­тений в фармакогнозии является способность клеток in vitro синтезировать самые разнообразные группы веществ: многочисленные фенольные соедине­ния, гликозиды, эфирные масла, каротиноиды, смолы, алкалоиды и другие природные соединения. Все они участвуют в обмене веществ растений и выполняют определенные, часто весьма существенные, функции,

В последние годы число сообщений о синтезе вторичных продук­тов в культурах тканей, представляющих ценность для фармацевтической промышленности, значительно возросло. Можно даже сказать, что переход от научных разработок к промышленному производству продуктов с использованием клеточных культур только начинается.