24. Классификация генов: гены структурного синтеза рнк, регуляторы. Свойства генов (дискретность, стабильность,

лабильность, полиаллелизм, специфичность плейотропия). Классификация генов. Другая группа структурных генов, обеспечивающих синтез некоторых белков-ферментов, в своем функционировании зависит различных регулирующих факторов и называется регулируемыми генами. Их активное функционирование, скорость и продолжительность транскрибирования могут регулироваться как генетическими факторами, так и факторами негенетической природы.

Генетическими факторами регуляции транскрипции являются гены-регуляторы и операторы. Гены-регуляторы определяют синтез белков-регуляторов, способных в активном состоянии соединяться с оператором, включающим или выключающим транскрипцию структурных генов. В зависимости от свойств белка-регулятора различают негативный и позитивный контроль транскрипции со стороны гена-регулятора. При негативном контроле белок-регулятор, соединяясь с оператором, прекращает (выключает) транскрипцию. Такой белок называется репрессором. При позитивном контроле белок-регулятор, соединяясь с оператором, включает транскрипцию. В таком случае продукт гена-регулятора называется апоиндуктором.

Таким образом, наряду со структурными генами с геноме имеются гены-регуляторы, которые, обеспечивая репрессию или депрессию структурных генов, регулируют процессы синтеза белка в клетке.

Наряду с генетическими факторами в регуляции экспрессии генов важная роль принадлежит факторам негенетической природы - эффекторам. К ним относятся вещества небелковой природы, расщепляемые или синтезируемые в клетке при участии различных ферментов.

В зависимости от того, как эффектор воздействует на активность генов, различают индукторы, включающие транскрипцию генов, и корепрессоры, выключающие ее. Действие эффектора заключается в его взаимодействии с белком-регулятором, при котором он либо активируется и может соединяться с оператором, либо инактивируется и теряет способность соединяться с оператором.

Таким образом, экспрессия генов является результатом регулирующего воздействия на процессы транскрипции как со стороны самого генома (гены-регуляторы и операторы), так и со стороны факторов негенетической природы.

25. Экспрессия генов в процессе биосинтеза белка. Регуляция экспрессии генов у прокариот и эукариот.

Регуляция экспрессии генов у прокориот. Изучение регуляции экспрессии генов на стадии транскрипции у прокариот привело к созданию в 1961 г. модели оперона (Жакоб и Мано). Оперон – это тесно связанная последовательность структурных генов, определяющих синтез группы ферментов для какой-либо одной из биохимических реакции.

Особенностью прокариот является транскрибирование иРНК со всех структурных генов оперона. Такая полицистронная иРНК в дальнейшем разрезается на фрагменты, соответствующие матрицам для синтеза отдельных ферментов. Цепи структурных генов оперона всегда предшествует промотор, узнаваемый РНК-полимеразой. У конститутивных генов этого достаточно для осуществления транскрипции. У регулируемых генов между промотором и структурными генами располагается оператор - последовательность нукдеотидов, которая узнается белком-регулягорбм (репрессором), находящимся в активном состоянии. Белок-репрессорпредставляет собой аллостерический белок, способный изменять свои биологические свойства при соединении с различными специфическими молекулами и обладает двумя высокочувствительными группами: одной из них он распознает оператор, другой - специфично связывает индуктор. Одновременно быть связанным с двумя молекулами он не может. Индуктор представляет низкомолекулярное вещество, которое связывается с репрессором и переводит его в неактивную форму, неспособную более связываться с оператором. Так, в Lас-системе индуктором является лактоза, после ассоциации с которой репрессор отсоединяетсяот оператора.

При отсутствии в среде лактозы активный репрессор, взаимодействуя с оператором, репрессирует гены А,В,С - транскрипции нет. Появление в среде лактозы инактивирует репрессор, он не соединяется с оператором и осуществляется транскрипция генов А, В, С, отвечающих за синтез ферментов, которые расщепляют лактозу.

Регуляция экспрессии генов у эукориот. У эукариот не установлено оперонной организации генов. Гены, определяющие синтез ферментов одной цепи биохимических реакций, могут быть рассеяны в геноме и очевино не имеют, как у прокариот, единой регулирующей системы. В связи с этим синтезируемые мРНК у эукариот моноцистронны, т.е. являются матрицами для отдельных пептидных цепей.

В настоящее время механизмы регуляции активности эукариотических генов интенсивно изучаются. Установлено, что регуляция транскрипции у эукариот является комбинационной, т.е. актвиность каждого гена регулируется большим спектром генов-регуляторов. У многих эукариотических генов, кодирующих белки и транскрибируемых РНК-полимеразой II, в ДНК имеется несколько областей, которые узнаются разными белками-регуляторами. Одной ю них является область, расположенная вблизи промотора. Она включает около 100 пар нуклеотидов, в том числе ТАТА-блок, располагающийся на расстоянии 25 пар нуклеотидов от точки начала транскрипции. Установлено, что для успешного присоединения РНК-полимеразы II к промотору необходимо предварительное соединение с ТАТА-блоком особого белка - фактора транскрипции - с образованием стабильного транскрипционного комплекса. Именно этот комплекс ДНК с белком узнается РНК-полимеразой II.

Другая область, играющая важную роль в регуляции активности эукариотических генов, располагается на большом расстоянии от промотора (до нескольких тысяч пар нуклеотидов) и называется ЭНХАНСЕЮМ (от англ. enhance - усиливать).

И энхансер, и препромоторный элемент эукариотических генов - это короткие последовательности нуклеотидов, которые связываются с соответствующими регулягорными белками. В результате взаимодействия этих белков происходит включение или выключение генов.

Для эффективной регуляции экспрессии генов у эукариот существуют мехзанизмы, работающие не только на стадии транскрипции, но и на других этапах этого процесса.

Связанная с экзон-интронной организацией генов необходимость процессинга, в том числе сплайсинга, делает возможным регуляцию этих процессов в ядре: используя один и тот же первичный транскрипт, можно обеспечить образование матриц для разных палтидов, вырезая из них разные последовательности или изменяя последовательности на 5^/ и 3^/ концах мРНК.

Транспорт зрелых мРНК из ядра в цитоплазму также регулируется: лишь небольшая часть РНК, транскрибируемая с генов, после сплайсинга покидает ядро. Значительное количество ее деградирует.

Существуют механизмы, обеспечивающие регуляцию процессов синтеза пептидных цепей. Они менее экономичны, но отличаются быстротой реагирования на изменения потребностей клетки в данном белке. Регуляция трансляции осуществляется на стадами инициации, когда блокируется присоединение к малой субъединице рибосомы тРНК, несущей формилметионин. В результате при наличии в цитоплазме иРНК трансляции на ней не происходит. Такая ситуация наблюдается, например, при отсутствии в цитоплазме гена, что ведет к выключению трансляции глобиновых цепей гемоглобина.

Регуляция процесса реализации наследственной информации может осуществляться и на стадии посттранслядионных изменений, когда происходит задержка в формировании активных молекул белка при наличии пептидных цепей. Например, для формирования активной формы инсулина из проинсулина должны вырезаться две субъединицы. Торможение этих процессов уменьшает выход конечного активного продукта.

26. Генетическая инженерия, ее задачи, методы, перспективы использования. Спонтанные и индуцированные мутации. Мутагенез и канцерогенез. Генетическая опасность загрязнения окружающей среды. Меры защиты.

Генетическая инженерия. Генетическая (генная) инженерия - область молекулярной биологии и генетики, ставящая своей задачей конструирование генетических структур по заранее намеченному плану, создание организмов с новой генетической программой. Возникновение генетической инженерии стало возможным благодаря синтезу идей и методов молекулярной биологии, генетики, биохимии и микробиологии. Основные методы генной инженерии были разработаны в 60-70-х годах нашего века. Они включают три основных этапа:

• получение генетического материала (искусственный синтез гена или выделение природных генов);

• включение этих генов в автономно реплицирующуюся генетическую структуру (векторную молекулу) и создание рекомбинантной молекулы ДНК;

• введение векторной молекулы (с включенным в нее геном) в клетку-реципиент, где она встраивается в хромосомный аппарат. Экспериментальный перенос генов в другой геном называется ТРАНСГЕНЕЗОМ.

Для ХИМИЧЕСКОГО СИНТЕЗА необходимо иметь полностью расшифрованную последовательность нуклеотидов. Впервые в 1970 году индийским ученым Корана Г. (США) был осуществлен искусственный синтез гена. Он синтезировал последовательность нуклеотидов (77) в ДНК, специфическую для структуры гена транспортной аланиновой РНК в клетках пекарских дрожжей. Более двух лет затратили на этот синтез гена. Последовательность нуклеотидов в нити ДНК определялась по информационной РНК. Для транскрипция необходимо, чтобы фермент РНК-полимераза "узнавала" место промотора, где локализована точка инициации синтеза, и в этом месте "садилась" на матрицу.

Однако, химическим путем можно синтезировать небольшие по размеру гены прокариот, синтез сложных генов эукариот, состоящих из тысячи и более нуклеотидов, путем химического синтеза пока создать не удается.

Кроме того, химический синтез очень трудоемкий и для генной инженерии в настоящее время практически не используется. Наиболее успешным оказался ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ гена.

Центральная догма молекулярной генетики утверждает, что считка информации происходит в направлении: ДНК → РНК → белок. Но ряд авторов, начиная с 1948 года, выступали с соображениями, что РНК может быть предшественником ДНК. Подобное наблюдается у онкогенных РНК - содержащих вирусов. С РНК-вируса, попавшего в клетку, синтезируется провирус (ДНК - копия РНК) с помощью фермента обратная транскриптаза (ревертаза), а сам процесс называется обратной транскрипцией. Этот фермент был открыт в 1970 году Теминым, Мазутани, Балтимором.

Ген, полученный путем ферментативного синтеза, может функционировать в бактериальной клетке, на нем синтезируется иРНК, а затем белок, таким путем под руководством академика В.А.Энгельгардга был получен ген, определяющий синтез фермента галактозидазы, введенный в фаг.

Следовательно, если иметь в пробирке выделенные молекулы иРНК, принадлежащие данному гену, то он может быть синтезирован с помощью фермента. Матрицей служит иРНК, ее выделяют, добавляют нуклеотиды, затравку, ферменты.

Важным достижением генной инженерии является синтез гена соматостатина, этот ген функционирует в микробной клетке.

Спонтанные и индуцированные мутации. Мутации делят на спонтанные и инду­цированные. Спонтанными называют мутации, возникшие под влиянием не­известных природных факторов, чаще всего как результат ошибок при ре­пликации ДНК. Индуцированные му­тации вызваны специально направлен­ными воздействиями, повышающими мутационный процесс.

Наследственные различия у микро­организмов, растений, животных и человека, в том числе наследственные болезни и уродства, появились в ре­зультате мутаций. Если спонтанные мутации — явление довольно редкое (частота—10^-6—10^-7), то применение мутагенных агентов значительно повы­шает частоту их.

Факторы, способные индуцировать мутационный эффект, получили назва­ние мутагенных. Установлено, что любые факторы внешней и внутренней среды, которые могут нарушить гомео-стаз, способны вызвать мутацию. Глав­нейшими мутагенами являются: хими­ческие соединения, различные виды излучений, биологические факторы.

Мутакинез. Химический мутагенез. Еще в 1934 г. М. Е. Лобашев отметил, что химические мутагены должны об­ладать тремя качествами: высокой про­никающей способностью; свойством изменять коллоидное состояние хро­мосом; определенным действием на со­стояние гена или хромосомы.

Приоритет открытия химических му­тагенов принадлежит советским иссле­дователям. В 1933 г. В. В. Сахаров получил мутации путем действия йода, в 1934 г. М. Е. Лобашев — применяя аммоний. В 1946 г. советский генетик И. А. Рапопорт обнаружил сильное мутагенное действие формалина и эти-ленимина, а английская исследователь­ница Ш. Ауэрбах — иприта. Позже были открыты многие другие химиче­ские мутагены. Некоторые из них усиливают мутационный эффект в сотни раз по сравнению со спонтанным; они получили название супермутагенов (лат. зирег — сверх), т. е. оказываю­щих сверхмутагенное действие. Мно­гие из супермутагенов, в частности использованные для получения вы­сокоактивных штаммов микроорганиз­мов — продуцентов антибиотиков, от­крыл И. А. Рапопорт.

Химические мутагены используются для получения мутантных форм плес­невых грибов, актиномицетов, бакте­рий, вырабатывающих в большом коли­честве пенициллин, стрептомицин и другие антибиотики. Химическими мутагенами повышена ферментативная активность грибов, применяемых для спиртового брожения. Разработаны де­сятки перспективных мутаций куль­турных растений.

В экспериментах мутации индуци­руются разнообразными химическими агентами. Этот факт свидетельствует о том, что, по-видимому, и в естествен­ных условиях подобные факторы так­же служат причиной появления спон­танных мутаций у различных химиче­ских веществ и даже некоторых лекар­ственных препаратов. Это говорит о необходимости изучения мутагенного действия новых фармакологических ве­ществ, пестицидов и других химиче­ских соединений, все шире используе­мых в медицине и сельском хозяйстве.

Радиационный мутагенез. Индуцированные мутации, вызванные облучением, впервые были экспери­ментально получены советскими уче­ными Г. А. Надсоном и Г. С. Фи­липповым, которые в 1925 г. наблю­дали мутационный эффект на дрожжах после воздействия на них ионизирую­щей радиации. В 1927 г. американ­ский генетик Г. Меллер показал, что рентгеновы лучи могут вызвать мно­жество мутаций у дрозофилы, а позже мутагенное воздействие рентгеновых лучей подтвердилось на многих объек­тах. В дальнейшем было установлено, что наследственные изменения обуслов­ливаются также всеми другими ви­дами проникающей радиации.

Для искусственных мутаций часто используются гамма-лучи, источником которых в лабораториях обычно явля­ется радиоактивный кобальт (⁶⁰Со). В последнее время для индуцирования мутаций все шире применяются ней­троны, обладающие большой прони­кающей способностью. При этом возни­кают как разрывы хромосом, так и точ-ковые мутации. Изучение мутаций, связанных с действием нейтронов и гамма-лучей, представляет собой ин­терес по двум причинам. Во-первых, установлено, что генетические послед­ствия атомных взрывов связаны преж­де всего с мутагенным влиянием иони­зирующей радиации. Во-вторых, фи­зические методы мутагенеза применя­ются для получения ценных в хозяй­ственном отношении сортов культур­ных растений. Так, советские исследо­ватели, используя методы воздействия физическими факторами, вывели стой­кие к ряду грибных заболеваний и бо­лее урожайные сорта пшеницы и ячменя.

Одним из самых опасных послед­ствий облучения является образова­ние свободных радикалов ОН или НО₂ из находящейся в тканях воды. Эти радикалы обладают высокой реактив­ной способностью и могут расщеплять многие органические вещества, в том числе нуклеиновые кислоты.

Другие мутагенные фак­торы. Первые исследователи мута­ционного процесса недооценивали роль факторов внешней среды в явлениях изменчивости. В начале XX в. неко­торые исследователи даже считали, что внешние воздействия не имеют ни­какого значения для процесса мутиро­вания. В дальнейшем зги представле­ния были отвергнуты благодаря искус­ственному воспроизведению мутаций с помощью различных факторов внеш­ней среды. В настоящее время можно предполагать, что нет таких факторов внешней среды, которое в какой-то мере не сказались бы на изменении на­следственных свойств. Из фичических факторов на ряде объектов установлено мутагенное действие ультрафиолето­вых лучей, фотонов света и температу­ры. Повышение температуры увеличи­вает число мутаций. Однако темпера­тура относится к числу тех агентов, в отношении которых у организмов существуют защитные механизмы, вследствие чего гомеостаз нарушается незначительно. В связи с этим темпе­ратурные воздействия дают небольшой мутагенный эффект по сравнению с другими агентами.

Найдены биологические мутагены, к которым относятся вирусы и токсины ряда организмов, особенно плесневых грибов. В 1958 г. советский генетик С. И. Алиханян показал, что вирусы вызывают мутации У актиномицетов. Оказалось так­же, что вирусы вызывают мутации у растений и животных При этом му­тагенным действием опладают не только те вирусы, к которым восприим­чив организм, в котором они размножаются и вызывают заболевание, но и непатогенные для него вирусы. Таким образом, роль вирусов в природе заключается в том, что они являются не только возбудителями многих болезней растений, животных и чел, но и виновниками многих спонтанных мутаций.