9.5.2. Метод спiнових мiток (спiнових зондiв)

Для вивчення структури i функцiй бiологiчних мембран з успiхом застосовується метод спiнових мiток, або спiно­вих зондiв.

Пояснимо суть цього методу. Похiдну стiйкого вiльного радикала, частiше нiтроксильного, зв’язують ковалентним зв’язком з будь-якою функцiональною групою бiлка або лiпiду, а потiм таку спiн-мiчену молекулу вбудовують в лiпiдний бiшар мембран, утворюючи так званий “спiновий зонд”. Форма сигналу спiнової мiтки залежить вiд оберталь­ної рухливостi зонда або тiєї його дiлянки, до якої вона “пришита” (мал. 9.27).

а)

б)

Мал. 9.27 Форми сигналу спінової мітки в залежності від рухливості зонда.

Використання методу спiнових зондiв дозволило вста­но­вити цiлий ряд цiкавих фактiв.

Мал. 9.28. Спінові зонди – спін-мічені аналоги стеаринових кислот.

1. Використовуючи в ролi спiнових зондiв спiн-мiченi аналоги стеаринових кислот i вводячи їх в оболонки еритро­цитiв (мал. 9.28), довели, що вiдносно суворий порядок роз­пов­сюджується на глибину не бiльш нiж вiсiм вуглецевих атомiв ланцюга вiд поверхнi в глибину мембрани. У на­прямку до центра лiпiдного бiшару рухливiсть жирно­кис­лот­них ланцюжкiв зростає. Оцiнка обертальної рухливостi дала можливiсть встановити, що мiкров’язкiсть лiпiдного бiшару в мембранi еритроцита приблизно дорівнює в’яз­костi рослинної олiї.

2. Аналогiчним чином, шляхом введення в бiологiчнi мембрани спiн-мiчених жирних кислот або синтезованих на їх основi фосфоліпiдів було виявлено змiну структури мембрани при рiзних випадках патологiї, а також пiд дiєю лiкiв та iнших бiологiчно активних сполук. Так, було показано, що анестетики збiльшують плиннiсть всерединi лiпiдного бiшару мембрани, а холестерин i ДДТ зменшують її.

3. Методом ЕПР було вперше експериментально дове­дено iснування фосфолiпiдного перевороту. Був виявлений повiльний фосфолiпiдний переворот (flip-flop) в мембран­них везикулах – лiпосомах, або фосфолiпiдних бульбашках (мал. 9.29). Саме таким переворотом можна пояснити меха­нiзм пасивного транспорту деяких iонiв через бiологiчнi мембрани.

Мал. 9.29. Фосфоліпідний переворот “flip-flop” в мембранах.

9.5.3. Спiн-iмунологiчний метод

Найпершим клiнiчним застосуванням методу спiнових мiток був спiн-iмунологiчний метод (СIМ), вперше описа­ний в лiтературi у 1972 р. Цей метод дозволяє встановити малi кiлькостi бiологiчно активних речовин (наприклад, нар­ко­тичних речовин) у рiдинах органiзму (сечi, слинi, кровi). Метод, заснований на витiсненнi мiченої сполуки немiченою, якщо вона присутня в розчинi, з її комплексу iз специфiчним антитiлом та вимiрюванням кiлькостi витiс­неної мiтки.

СIМ складається з трьох етапiв:

а) синтез спiн-мiченої моделi даної бiологiчно-активної сполуки;

б) одержання специфiчних антитiл проти даної речови­ни;

в) визначення за допомогою комплексу спiн-мiченої сполуки з антитiлом вмiсту шуканої бiологiчно активної речовини у бiологiчних рiдинах.

Яким же чином здiйснюється якiсний i кiлькiсний ана­лiз на бiологiчно активну речовину? При зв’язуваннi спiн-мiченого морфiна з молекулою антитiла його обертання стає більш повiльним, i спектр стає характерним для iмобiлiзо­ва­ного радикала (мал. 9.30, а).

а)

б)

Мал. 9.30. Ілюстрація спін-імунологічного методу.

Якщо тепер цей комплекс помiстити в середовище, що вмiщує морфiн або спорiдненi йому сполуки, якi мають бiльшу константу зв’язку з антитiлами, то спiн-мiчений морфiн буде пiдлягати обмiну i витiснятись iз комплексу з антитiлом, при цьому спектр ЕПР буде змiнюватись на характерний для незв’язаного радикала (мал. 9.30, б). Ця змiна пiддається оцiнцi i дозволяє визначити концентрацiю морфiноподiбних сполук у розчинi.