- •Тема 1. Асептика в биотехнологических процессах.
- •Элементы асептики в биотехнологии
- •Экспериментальная часть
- •Расчетная часть
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •Тема 2. Метаболизм углеродсодержащего субстрата. Периодическое культивирование дрожжей на различных углеродных субстратах
- •Биохимические особенности роста микроорганизмов на углеродных субстратах
- •Стехиометрия процессов культивирования микроорганизмов
- •Формула биомассы микроорганизмов. Молекулярный вес биомассы (биомоль)
- •Экспериментальная часть
- •Подготовка посевного материала
- •Приготовление питательных сред
- •Построение калибровочного графика
- •Условия культивирования
- •Методы аналитических исследований
- •Расчетная часть
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •Тема 3. Ингибирование роста микроорганизмов в условиях периодического культивирования
- •Описание кинетики ферментативных реакций
- •Описание кинетики микробного роста
- •Экспериментальная часть
- •Расчетная часть
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •Примерные темы самостоятельных работ к семинарским занятиям
Литература
1. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. – М.: Высшая шк., 2004. – 356 с.
2. Манаков М.Н., Победимский Д.Г. Теоретические основы технологии микробиологических производств. – М.: Агропромиздат, 1990. – с. 97-99, 173-205.
3. Еникеев Ш.Г., Белялова З.М., Валеев Р.И. и др. Получение микробной биомассы на основе этилового спирта. – Казань: КХТИ, 1988. – 32 с.
4. Кантере В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств. – М.: Агропромиздат, 1990. – 271 с.
5. Решетник О.А. Общая микробиология. – Казань: КХТИ, 1984. – с. 59-66.
6. Егоров Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. – М.: Академия, 2003. – 208 с.
7. Микробная биотехнология / Лещинская И.Б. Куриненко Б.М., Вершинина В.И. и др. – Казань: Унипресс: ДАС, 2000. – 368 с.
8. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – С-Пб.: Наука, 1995. – 600 с.
9. Беккер М.Е., Лиепиныш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. – М.: Агропромиздат, 1990. – 334 с.
10. Промышленная микробиология / Под ред. Н.С. Егорова. – М.: Высшая школа, 1989. – 688 с.
Тема 3. Ингибирование роста микроорганизмов в условиях периодического культивирования
В процессе микробного роста в клетках протекают разнообразные биокаталитические реакции, которые протекают с участием множества ферментов.
Описание кинетики ферментативных реакций
При взаимодействии фермента (E) с субстратом (S) образуется фермент-субстратный комплекс (ЕS) за счет сил физической природы. Различают 2 стадии ферментативной реакции, из которых собственно только вторая является биохимическим каталитическим превращением:
k+1 k+2
E + S ES E + P (3.1)
k-1
химическая реакция
Скорость образования продукта (Р) равна:
V=k+2[ES] (3.2)
Константа диссоциации фермент-субстратного комплекса (ES) определяется как
Ks = [E][S] / [ES] (3.3)
Общая концентрация фермента (E0) определяется суммарной концентрацией индивидуального фермента и фермента, связанного в комплексе с субстратом:
[E0] = [E] + [ES], откуда [E] = [E0] - [ES] (3.4)
Из уравнения (3.3) следует
[ES] = [E][S] / Ks (3.5)
Подставляя (3.4) в (3.5), получаем
[ES] Ks = [E0] [S] - [ES] [S], откуда
[ES] Ks + [ES] [S] = [E0] [S] или [ES] (Ks + [S]) = [E0] [S]
[ES] = [E0] [S] /(Ks + [S]) (3.6)
Подставляя (3.6) в (3.2), получим
V = k+2 [E0] [S] / (Ks + [S]) (3.7)
k+2 [E0] – максимальная скорость ферментативной реакции Vmax, когда
[ES]=[ E0], т.е. весь фермент связан в фермент-субстратном комплексе, т.е.:
V = Vmax [S] / (Ks + [S]) (3.8)
Константу диссоциации Ks называют константой Михаэлиса и обозначают Km в уравнении (3.8) :
V = Vmax [S] / (Km + [S]) (3.9)
Уравнение (3.9) представляет собой уравнение Михаэлиса-Ментен, которое учитывает лимитирование скорости реакции концентрацией субстрата. Этим уравнением Л. Михаэлис и М.Л. Ментен в 1913 году описали кинетику простых ферментативных реакций, не осложненных цепью сложных и разветвленных превращений субстрата в различные продукты, а также не связанных с ингибированием фермента.
В уравнении (3.9) константа Михаэлиса Km является мерой сродства фермента к субстрату и численно равна концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции равна половине от максимальной (V=Vmax/2).
Чем меньше значение Km, тем выше сродство фермента к данному субстрату, субстрат быстрее претерпевает превращение, т.е. быстрее протекает ферментативная реакция.
Графическим образом уравнения Михаэлиса-Ментен является гипербола (рис. 3.1). Как любая нелинейная функция, она неудобна для нахождения параметров уравнения – Km и Vmax.
Рис. 3.1 – Гипербола - графический образ уравнения Михаэлиса-Ментен
Для нахождения численных значений Km и Vmax уравнение приводят к линейной зависимости (y=a+bx) различными способами. Наиболее традиционным является зависимость Лайнуивера-Берка, представляющая собой уравнение Михаэлиса-Ментен в обратных координатах (1/V = f(1/S)):
1/V = (Km + [S])/(Vmax [S]) =
Km/(Vmax [S]) + [S]/(Vmax [S]) = 1/Vmax + (Km/Vmax)(1/[S]) (3.10)
Таким образом, параметры уравнения Михаэлиса-Ментен легко найти из линеаризованного уравнения y=a+bx (рис. 3.2):
а = 1/Vmax (отрезок на пересечении прямой с осью у (1/V));
b = Km/Vmax (тангенс угла наклона прямой к оси x (1/S));
или -1/Km (отрезок на пересечении прямой с осью x (1/S)).
Рис. 3.2 – Зависимость Лайнуивера-Берка - линеаризованное уравнение Михаэлиса-Ментен