Тема 2. Метаболизм углеродсодержащего субстрата. Периодическое культивирование дрожжей на различных углеродных субстратах

Живая клетка – сложный биохимический реактор для проведения более 1000 независимых одновременно протекающих биокаталитических процессов превращения веществ, совокупность которых называется метаболизмом клетки.

Процессы метаболических превращений сложных веществ (полисахаридов, липидов, белков и др.) в простые (например, СО₂ и Н₂О) с целью получения энергии (для энергетического обмена) называются катаболическими, а их совокупность – катаболизмом клетки.

Процессы метаболических превращений с целью построения клетки с биосинтезом белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов и др. сложных, богатых энергией веществ из простых (для конструктивного обмена) являются энергопотребляющими и называются анаболическими, а их совокупность – анаболизмом клетки.

Процессы биосинтеза низкомолекулярных веществ – аминокислот, нуклеотидов, моносахаридов – компонентов для биосинтеза биополимеров - белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов называются амфиболическими, а их совокупность – амфиболизмом клетки. Амфиболические процессы обеспечивают клетку энергией и исходными для анаболизма веществами.

Метаболические процессы и реакции в клетке объединяются в определенные последовательности, называемые путями метаболизма.

В результате анаболизма и амфиболизма синтезируются первичные и вторичные метаболиты.

Первичные метаболиты – это продукты метаболизма, необходимые для роста микроорганизмов и выступающие в качестве строительных блоков макромолекул и коферментов. К ним относятся аминокислоты, витамины, ферменты, органические кислоты и др.

Вторичные метаболиты – это продукты метаболизма, в которых микроорганизмы не нуждаются для собственного роста. К ним относятся антибиотики, токсины, алкалоиды и др.

Биохимические особенности роста микроорганизмов на углеродных субстратах

Вообще говоря, под субстратом понимается органическое или неорганическое вещество, взаимодействующее с ферментом с образованием фермент-субстратного комплекса, в результативном случае приводящего к получению продуктов ферментативной реакции.

Подавляющее большинство микроорганизмов в качестве углеродного субстрата предпочитают использовать углеводы – моно- и дисахариды, прежде всего гексозы (глюкозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, сахарозу и др.).

Природа микроорганизма обусловливает выбор одного из путей катаболизма глюкозы в качестве доминирующего пути: Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, пентозофосфатный, Энтнера-Дудорова, дыхание и др.

Метаболический путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса (ЭМП)

К атаболизм глюкозы по пути ЭМП включает 10 биокаталитических стадий (рис. 2.1).

Рис. 2.1 – Схема метаболического пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса

Исходным субстратом является глюкоза, конечным продуктом – пировиноградная кислота (ПВК, пируват). Катаболизм глюкозы состоит в ее фосфорилировании, а также фосфорилировании промежуточных соединений с накоплением максимума энергии субстрата внутри клетки, поскольку сильно ионизированные органические вещества не диффундируют через клеточную мембрану из клетки и являются источником энергии для конструктивного и энергетического обмена. Накопление внутриклеточной энергии вследствие присоединения фосфатной группы HPO₄^2- к молекулам органического субстрата называют субстратным фосфорилированием.

В процессе катаболизма глюкозы осуществляются энергозатратные реакции, когда изменение свободной энергии ∆G≥0; энергодающей реакцией для их протекания является сопряженная реакция гидролиза АТФ (рис. 2.1). Спонтанные реакции фосфорилирования АДФ с образованием АТФ осуществляются, начиная с превращения двух молекул 3-фосфоглицеринового альдегида через ряд промежуточных продуктов в две молекулы пирувата (рис. 2.1). Таким образом, катаболизм 1 молекулы глюкозы с образованием 2 молекул пирувата сопровождается первоначальным гидролизом 2 молекул АТФ и последующим образованием 4 молекул АТФ.

Общая стехиометрия пути ЭМП выглядит следующим образом:

С ₆Н₁₂О₆ + 2Р_i + 2АДФ + 2НАД⁺ 2С₃Н₄О₃ + 2АТФ + 2(НАДН+Н⁺) (2.1)

Глюкоза ПВК

В результате катаболизма глюкозы по пути ЭМП клетка получает следующие преимущества:

- запасается химическая энергия (АТФ)

- образуются восстанавливающие эквиваленты (НАДН+Н⁺)

- синтезируются биосинтетические предшественники (ПВК).

Поэтому этот путь метаболизма является амфиболическим.

В клетках мышечных тканей и молочно-кислых бактериях путь ЭМП не завершается образованием пирувата; пируват восстанавливается до молочной кислоты (лактата):

С ₃Н₄О₃ + НАДН + Н⁺ С₃Н₆О₃ + НАД⁺ (2.2)

пируват лактат

Вся последовательность биохимических реакций, начинающая с глюкозы и завершающаяся молочной кислотой называется гликолизом.

В зависимости от потребностей в важнейших биосинтетических предшественниках метаболизма (пирувата, ацетилкофермента А, органических кислотах), в энергии (АТФ и других макроэргических соединениях), в восстановительных эквивалентах (НАДН и НАДФН) микробные клетки могут использовать и другие пути метаболизма, например, пентозофосфатный, Энтнера-Дудорова, дыхание.

При этом общий принцип метаболизма субстратов состоит в том, что клетки могут использовать субстрат, пользуясь несколькими путями катаболизма одновременно для обеспечения своего оптимального развития за счет удовлетворения потребностей в энергии и в синтезе предшественников биополимеров.

Метаболизм этанола

Первичное окисление этанола осуществляется последовательно двумя ферментами: НАД-зависимой алкогольдегидрогеназой и НАД-зависимой дегидрогеназой. Первый фермент локализован в митохондриях и ответственен за проведение реакций окисления этанола в ацетальдегид.

В цитоплазме обнаружен еще один тип дегидрогеназы (растворимый). Однако этот фермент участвует в проведении обратной реакции превращения ацетальдегида в этанол. Этот процесс обычно наблюдается при спиртовом брожении, в то время как реакция (1) доминирует при росте дрожжей на этаноле.

Ацетальдегид, в свою очередь, под действием НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы превращается в ацетилкофермент А (СН₃СОКоА, ацетил-КоА).

(2.4)

В результате двухступенчатого окисления этанола образуется 2 моля НАДН из 1 моля этанола. При недостатке кислорода клетка может выделять в окружающую среду уксусную кислоту. Она образуется за счет конверсии ацетилкофермента А с участием неорганического фосфата под действием фосфатацетилтрансферазы до фосфоацетилфосфата и дальнейшего превращения последнего в уксусную кислоту под действием ацетаткиназы.

(2.5)

В этом случае затрачивается 1 моль кислорода на 1 моль этанола, клетка продуцирует 5 молей АТФ. Ацетилкофермент А включается в ЦТК при конденсации с оксокислотами. Часть ацетил-КоА сразу включается в глиоксилатный шунт. Глиоксилатный шунт представляет собой обходной путь реакций превращения изолимонной кислоты в яблочную (рис. 2.2). Если в цикле Кребса изолимонная кислота путем двух стадий декарбоксилирования превращается через α-кетоглутаровую и янтарную кислоты в яблочную, то здесь эти две стадии декарбоксилирования отсутствуют. Изолимонная кислота путем альдольного расщепления превращается в янтарную и глиоксиловую кислоты. Эту реакцию катализирует изоцитратлиаза. Глиоксиловая кислота путем конденсации с ацетил-КоА образует яблочную кислоту под действием малатсинтазы. Таким образом, при каждом обороте цикла за счет включения второй молекулы ацетил-КоА синтезируются дополнительные молекулы янтарной кислоты. Она используется клеткой для биосинтеза.

Рис. 2.2 – Биохимическая схема ассимиляции

углеродных субстратов дрожжами

На рис. 2.2 отмечена передача пяти пар протонов (2Н), высвобождающихся в цикле ЦТК, в электронтранспортную дыхательную цепь с их окислением до Н₂О. Сопряженный с этим процесс регенерации АТФ в дыхательной цепи с накоплением внутриклеточной энергии называется окислительным фосфорилированием.