Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Біотехнологія. Лекція 3..doc
Скачиваний:
17
Добавлен:
09.11.2018
Размер:
142.85 Кб
Скачать

Носії для іммобілізованих ферментів

Носії (матриці) для іммобілізованих ферментів — це частіше всього органічні полімерні матеріали природного або синтетичного походження.

До перших слід віднести такі природні носії як полісахариди (пориста целюлоза, агароза, губчатий крохмаль, глікоген, альгінові кислоти та їх солі, хітин, гепарин та ін.), білки (колаген, кератин, нерозчинні білки — глобуліни бавовнику, казеїн, міозин, фібриноген, фіброїн та ін.), ліпосоми.

Із синтетичних полімерних носіїв слід відмітити матриці виготовлені на основі акрилової кислоти, полівінілового і поліалілового спиртів, поліуретанові полімери, полістироли, нейлон та ін.

Із адсорбентів неорганічної природи частіше всього використовуються синтетичні макропористі кремнеземні матеріали: пористе скло, силікагель, сілохром, а також природні носії, як пісок, глини, ціоліти, активоване вугілля, кераміка з контрольованими розмірами пор, оксиди металів.

Ідеальних носіїв не буває. Так, гранули пористої целюлози по багатьох параметрах переважають сучасні полімерні матеріали (механічна міцність, невисока вартість, реакційна здатність, відсутність неспецифічної взаємодії), але піддається дії мікробів.

Для попередження деяких негативних властивостей носії модифікують. Так, оброблена формальдегідом, гліоксалем або глутаровим альдегідом молекула губчатого крохмалю модифікується за рахунок утворення зшивок і стає стійкою до гідролаз (ферментів що гідролізують полісахариди).

При покритті поверхні кремнеземних сорбентів плівкою оксидів Al, цирконію, гафнію, титану зменшується їх розчинність у лужному середовищі і знищується неспецифічна сорбція.

Найбільш підходящим носієм для ферментів при хімічних методах іммобілізації являється целюлоза та її похідні. Цей полімерний матеріал володіє такими цінними властивостями, як висока гідрофільність та здатність порівняно легко давати широкий спектр похідних у вигляді порошку, гранул або плівок. Доцільно ковалентно з’єднувати ферменти і матрицю не прямо, а через посередник (місток). Молекула цієї сполуки повинна бути невеликого розміру і містити більше однієї реакційноздатної групи. Такими властивостями володіють поліфункціональні реагенти, наприклад: глутаровий альдегід, хлористий ціанур, 2, 4-динітро-3, 5-дифторбензол та ін.

CI

С

N N

N≡N+ N+≡N

C C

CI N CI SO3 SO3

Хлористий ціанур N,N'-бісдіазобензидин-2,2'-дисульфокислота

NO2

O O

F F C – CH2 – CH2 – CH2 – C

H H

NO2 глутаровий альдегід

2,4-динітро-3,5-дифторбензол

Поліфункціональні сполуки придатні також і для зв’язування молекул ферменту між собою, тут краще інших зарекомендував себе глутаровий альдегід.

Один із основних недоліків цих сполук — їх здатність взаємодіяти з функціональними групами (активним центром), внаслідок чого фермент інактивується. Але застосовують зворотне блокування (захист активного центру) глутатіоном, цистеїном та ін. (якщо він утворений SN-групами) після іммобілізації ферменту. В інших випадках для блокування додають субстрат в насичуючій активний центр ферменту концентрації.

При виборі методу іммобілізації враховують природу каталізованої реакції, механічні властивості і фізичну форму носія. Ідеального методу іммобілізації немає.

Для одержання іммобілізованих ферментів з раніше запланованими параметрами можна також активізувати поверхні, частіше всього модифікованого носія, шляхом переведення, наприклад, NO2-фукціональних груп в реакційно здатні солі діазонію; СООН–групи карбоксилвмісних матриць послідовною обробкою хлористим тіанолом а потім імідазолом активізуються, перетворюючись в імідозоліди, які набувають здатність взаємодії з різними нуклеофілами (сполуками, що містять аміногрупи).

О O HC = N O HC = N

R – С + SOCI2 R – C + HN R – C – N

ОН CI HC = CH HC = H

Полімер хлористий імідазол імідазолід

тіанол

Існує велика кількість способів модифікації матриці і активування їх функціональних груп. Від того з якими функціональними групами носія реагує фермент при його іммобілізації залежіть ємність матриці (ємність носія — це маса білка зв’язана одиницею його маси(» 40 - 150 мг на 1 г носія).

Роботи з пошуку нових носіїв для одержання іммобілізованих ферментів йдуть паралельно з вивченням способів зв’язування матриці і ферменту з метою одержання біологічно активних речовин з високим ефектом при їх використанні в біотехнології, медицині, аналітиці, харчовій промисловості.

Розроблений також метод реактивації денатурованих ферментів (відновлення початкової конформації глобули). Якщо денатуровану молекулу розвернути (це досягається дією сильних, але зворотних денатурантів таких як сечовина або гуанідін разом з відновниками типу дитіотреітол, який відновлює зв’язки —S—S— до —SH) а потім дати їй можливість повільно звернутись, забравши денатуранти і замінивши відновник на окиснювач, (звичайно це кисень повітря), то утвориться знову активна молекула.

Іммобілізують не лише виділені ферменти, але і цілі клітини мікроорганізмів. Частіше всього їх включають в поліакриламідний гель або в гель каррагінану (полісахарид з морських водоростей). Розроблений спосіб іммобілізації клітин мікроорганізмів з високою аспартазною активністю шляхом їх включення в гель полісахариду морських водоростей каррагінану. Так біотехнологія одержання L-аспарагінової кислоти з фумарату амонію за допомогою іммобілізованих клітин мікроорганізмів стала без конкуренції.

Переваги цього методу в тому, що процес дешевший, крім того, ферменти в клітинах частіше стабільніші ніж виділені. Недоліком є низька проникаюча можливість клітинних оболонок для субстратів.

Оцінку ефекту стабілізації або дестабілізації проводять порівнянням kін. (коефіцієнт інактивації) вихідного і модифікованого (іммобілізованого) ферменту.

kін. — швидкість інактивації ферменту на певній стадії (50% або 75%) або враховується час, на протязі якого активність зменшується у два рази (напівперіод життя).

Більш складна проблема стабілізації ферментів. Що призводить до інактивації ферментів? По-перше, як і всі білки, вони можуть бути «з’їдені»мікроорганізмами;

по-друге, може відбуватись міжмолекулярна агрегація білкових молекул, а у випадку гідролітичних ферментів так званий автоліз тобто гідроліз ферментів під їх же дією;

по-третє, молекула ферменту може втратити структуру у результаті порушення бокових груп поліпептидного ланцюга під дією t, рН, органічних розчинників (денатурація). Як правило, білкова глобула при цьому розвертається і переходить у клубок. Активний центр ферменту руйнується;

по-четверте, інактивація може відбуватися за рахунок хімічної модифікації функціональних груп (реакція з домішками).

Перша причина частково знімається при іммобілізації ферментів в пористих носіях (екран від мікроорганізмів). Більш універсальний спосіб — проведення процесу в умовах пастеризації при 70°С (але можлива інактивація). Ставка робиться на ферменти термофільних мікроорганізмів. Також розроблені прийоми стабілізації ферментів в умовах підвищеної t°. Суть більшості з них у тому, що вони штучно закріплюють каталітично активну конформацію ферменту. Для цього обробляють фермент якимось зшиваючим реагентом, наприклад, диальдегідом. Найбільш розповсюджений — глутаровий альдегід (НОС(СН2)3СОН). У результаті його взаємодії з аміногрупами ферменту з’являються додаткові зв’язки між ділянками поліпептидів, які перешкоджають розвертанню глобули.

Третій підхід — фермент включають в «тісні» пори носія. Тоді стінки пор перешкоджають розвертанню. У наш час досліджуються термофільні мікроорганізми і виділення з них ферментів. Проведення біотехнологічних процесів при t 60-70 до 110 °C вирішить багато проблем у виробництві різноманітної продукції.