6. Імобілізація і стабілізація ферментів

Широкі дослідження розпочалися у 60 — 70-х роках коли назріла потреба розробки технологічних стабільних ферментних препаратів. Використанню ферментів на практиці заважали дві обставини. По-перше, ферменти, як правило, гомогенні каталізатори, що дуже незручно з технологічної точки зору, так як каталізатор важко відділяти від продуктів реакції і використовувати повторно. Біотехнологічний процес не може бути неперервним і автоматизованим. По-друге, ферменти досить нестабільні і звичайно не можуть функціонувати достатньо довго. На протязі останніх 20-ти років ці проблеми були вирішені. Перша — шляхом розвитку методів іммобілізації ферментів. Це така процедура у результаті якої молекула ферменту одним із способів прикріплюється до об‘єкта, не розчинного у воді. Після завершення реакції вони легко відділяються з розчину. Проблема стабілізації вирішувалась розвитком таких методів іммобілізації, які одночасно призводили до зміцнення білкової глобули. Також збільшення стабільності ферментів (у 100-1000 р.) досягали шляхом створення особливих умов проведення процесу і застосування хімічної модифікації носія.

Методи іммобілізації

Розрізняють: фізичні (адсорбування ферментів на поверхні матриці і утримання його за рахунок електростатичних сил, гідрофобних, водневих зв‘язків, Ван-дер-Ваальсових взаємодій) та хімічні (утворення ковалентних зв’язків між ферментом і матрицею) методи іммобілізації.

Простий і найбільш старий спосіб іммобілізації полягає в адсорбції ферментів на твердому носії неорганічної (силікагель, оксид Al, активоване вугілля і т. д.) або органічної (іоніти, полісахариди) природи. Неорганічні носії мають хороші механічні властивості. Особливо зручні пористі скло і кераміка. Але їх недолік - значна неспецифічна сорбція побічних речовин і часто недостатньо міцне закріплення ферментів на носії.

Більше розповсюдження отримав інший фізичний метод: включення ферментів в різні полімерні гелі (одержується тривимірна сітка). Тому у випадку високомолекулярних субстратів метод непридатний. Найбільшого розповсюдження набув метод включення ферментів в поліакриламідний гель. Ферменти вводять у розчин акриламіду (СН₂ = СНСОNН₂) і зшиваючого реагенту бісакриламіду (СН₂ = СНСОNНСОСН = СН₂) додають ініціатор полімеризації, наприклад, (NH₄)₂S₂O₈ і одержується гель з іммобілізованим ферментом.

Останній метод фізичної іммобілізації — включення ферменту в мікрокапсули і волокна. Тут фермент залишається у своєму звичному водному середовищі. Крапельки водного розчину ферменту розпилюють в органічному розчиннику і на межі поділу фаз виникає оболонка (мембрана) за рахунок міжфазної полімеризації (або зниження розчинності полімеру, присутнього в одній із фаз). Мембрана мікрокапсули проникна для низькомолекулярних субстратів, але не проникна для ферменту (як і у випадку гелів). Капсули легко відділяються фільтруванням.

Щоб утворились волокна спочатку одержують емульсію водного розчину ферменту в органічному розчиннику, що містить полімер, здатний утворювати волокна (триацетат целюлоза (ТАЦ), нітроцелюлоза, етилцелюлоза). Потім цю емульсію продавлюють через тонкі отвори в інший розчинник, який викликає коагуляцію полімеру. Одержуються волокна, які містять мікрокрапельки водного розчину ферменту.

Суть хімічних методів іммобілізації ферментів полягає в утворенні ковалентних зв’язків між носієм і ферментом. Дуже перспективний метод поєднання ковалентної „зшивки” з включенням в гель.

Ковалентна іммобілізація — найбільш надійний спосіб утримання ферменту на носії. У наш час промисловість випускає носії для ковалентної іммобілізації. Але вартість таких ферментних каталізаторів істотно зростає.