5. Одержання очищених ферментних препаратів

Більша частина гідролітичних ферментів легко видаляється з культури грибів, бактерій так як у клітинах, де закінчились процеси метаболізму, проникаюча здатність оболонки збільшується і ферменти переходять з клітини в навколишнє середовище або воду при екстрагуванні. У виробничих умовах важливо не розбавляти екстракти, не знижувати концентрацію ферментів, тому що багато розчинників буде витрачатись на їх осадження.

Для видалення ферментів застосовують дифузійний метод (використовується у виробництві цукру, олії, гідролізату білків сої).У батареї дифузорів здійснюється протитечія води і відфільтрованої культури (міцелію) так, що концентрація речовин збільшується по мірі руху їх розчину і збирається із завантаженого свіжого матеріалу. Так вилучається 90-95 % ферментів Екстракт не містить нерозчинних домішок. Дифузію проводять водою при t 25-28 ⁰C з додаванням формаліну, фільтром є сама культура. Екстракт – темнозабарвлений розчин, що містить 10-15 % сухих речовин.

Цей розчин можна упарювати у 3-5 разів у вакуум-апаратах, де t кипіння » 30 ⁰С, до концентрації 50-55%. Застосування рідких впарених сиропів розповсюджено для обробки шкіряної сировини, в текстильній промисловості, у виробництві сиру. Також існують способи висушування не упарених і частково упарених розчинів на розпилювальній сушилці. Так одержують сухі технічні препарати. Але для більшості галузей промисловості (харчова, легка, медицина) необхідні більш або менш очищені препарати ферментів.

Самий розповсюджений метод одержання більш очищених препаратів у вигляді порошку – це осадження ферментів органічними розчинниками – етиловим, ізопропіловим спиртами, ацетоном. У водно-спиртових розчинах ферментні білки випадають в осад, тому що зниження діелектричної константи сприяє взаємодії білкових молекул, вони утворюють агрегати і осідають. Осад швидко промивають (2-3 рази) спиртом для видалення води і висушують у центрифузі, вакуум-сушилці. Такі препарати є комплексами різних ферментів. Якщо необхідно розділити, наприклад, амілази і протеази, то використовують різну розчинність фермента у сиртових розчинах різної концентрації. При концентрації спирту 50-52% осідає 90% протеаз, амілази осаджують 76% спиртом.

Другий метод виділення ферменту з розчину – висолювання нейтральними солями (сульфат амонію), воно більш специфічне для білків і тому препарати мають більшу активність ніж при спиртовому осадженні. Фракціонування, виділення посторонніх білків теж відбувається на основі їх різної розчинності у розчинах з різною концентрацією. Недоліком є складнощі з регенерацією (видаленням) солі. Найбільш ефективним способом очистки екстракту є діаліз, при його застосуванні підвищується активність ферментних препаратів.

Більш ефективним методом концентрування ферментів є сорбція їх на іонообмінних смолах або ПАР з подальшою елюцією. Гомогенність виділених препаратів встановлюється декількома методами. Із них найбільш надійні гельфільтрація, електрофорез, ультрацентрифугування. Якщо всі методи підтверджують гомогенність, тоді одержаний індивідуальний ферментний білок.

Для видалення високоочищених і гомогенних препаратів ці методи використовують у різному поєднанні і послідовності. Часто доводиться повторювати прийоми. Іноді застосовують речовини, які утворюють із ферментом нерозчинні сполуки, наприклад, це утворення комплексу –амілази з риванолом (використ. Японія).