Занятия / Методы / АнемииГемолитичЛабДиагностика

Министерство здравоохранения Республики Беларусь

Гомельский государственный медицинский институт

Кафедра лабораторной диагностики и иммунологии

Утверждено на заседании кафедры

Протокол №…. от…. 2001 года

Заведующий кафедрой, к.м.н.

______________ И.В.Тарасюк

Гемолитические анемии. Лабораторная диагностика.

Учебно-методическое пособие для студентов

Автор: ассистент Жукова Е.Г.

Гомель, 2001 год

Введение.

Реакция усиленного разрушения эритроцитов является стереотипной реакцией адаптации системы крови в ответ на действие экстремальных факторов (механическая, тепловая энергия, ультразвук, кровопотеря, воздействие чужеродных агентов, антигенная стимуляция, УФО, ускорения и т.д.). Кроме того, повышенный гемолиз возникает вследствие целого ряда наследственных аномалий строения эритроцитов. Таким образом, гемолитические анемии представляют собой обширную группу гематологических заболеваний, в диагностике и дифференциальной диагностике которых важное место отводится лабораторным тестам. Все вышесказанное обуславливает актуальность данной темы.

Цель:

• Изучить клинико-лабораторные признаки внутриклеточного и внутрисосудистого гемолиза.

• Изучить классификацию, этиопатогенез и основные клинические синдромы гемолитических анемий.

• Получить знания о клинико-лабораторной диагностике гемолитических анемий.

Задачи:

• знать клинико-лабораторные признаки внутриклеточного и внутрисосудистого гемолиза;

• знать классификацию, этиопатогенез и основные клинические синдромы наследственных и приобретенных гемолитических анемий;

• уметь проводить лабораторную диагностику гемолитических анемий;

• уметь определять осмотическую резистентность эритроцитов, проводить пробу Хема, сахарозную пробу, ставить качественную реакцию определения дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

Практические навыки:

• Проведение лабораторной диагностики гемолитических анемий.

• Определение осмотической резистентности эритроцитов.

• Проведение теста Хема.

• Постановка сахарозной пробы.

• Постановка качественной реакции определения дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

Основные учебные вопросы:

1. Классификация гемолитических анемий.

2. Клинико-лабораторные показатели внутриклеточного и внутрисосудистого гемолиза.

3. Этиопатогенез и клинико-лабораторная диагностика наследственных гемолитических анемий, обусловленных изменениями мембраны эритроцитов.

4. Этиопатогенез и клинико-лабораторная диагностика наследственных гемолитических анемий, обусловленных изменениями активности ферментов.

5. Этиопатогенез и клинико-лабораторная диагностика наследственных гемолитических анемий, обусловленных нарушением синтеза гемоглобина.

6. Этиопатогенез и клинико-лабораторная диагностика пароксизмальной ночной гемоглобинурии (болезнь Маркиафавы – Микели).

7. Этиопатогенез и клинико-лабораторная диагностика приобретенных гемолитических анемий.

Вспомогательные материалы по теме:

Любое состояние организма, сопровождающееся преждевременным распадом эритроцитов, называется гемолитической анемией (ГА). Наиболее важной задачей клинициста являются установление механизма гемолитического процесса в каждом конкретном случае, а также оценка его степени и вклада анемии в симптомокомплекс основного заболевания.

Все ГА делятся на 2 большие группы — иммунные и неиммунные.

Дадим краткую характеристику неиммунных гемолитических анемий. К ним относятся:

1. Врожденные ГА.

Мембранопатии (наследственный микросфероцитоз, овалоцитоз, стоматоцитоз, эллиптоцитоз, пиропойкилоцитоз).

Ферментопатии (наиболее распространенные из них — дефицит в эритроцитах ферментов Г-6-ФД и глутатионредуктазы).

Гемоглобинопатии (талассемии и различные варианты носительства нестабильного НЬ).

2. Приобретенные ГА:

Маршевая гемоглобинурия и другие виды механического гемолиза, из которых наиболее известен гемолиз вследствие протезирования клапанов с использованием тефлоновых покрытий.

Анемия при терминальном циррозе печени (spurr-cell anaemia) как следствие нарушения липидного состава мембраны эритроцитов.

Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ). Заболевание обусловлено патологией стволовой клетки кроветворения, приводящей к нарушению синтеза белков эритроцитарной мембраны, защищающих эритроцит от прямого лизиса системой комплемента. В основе заболевания лежит мутация гена PIG – A, отвечающего за синтез фосфоинозитола, фиксирующего ряд белков на поверхности кроветворных клеток, среди которых имеются белки, защищающие клетки крови от лизиса комплементом (CD55 и CD59). При ПНГ повышенной чувствительностью к комплементу обладают все клетки периферической крови. В последние годы доказана клональность ПНГ и описаны случаи трансформации заболевания с течением времени в острый лейкоз.

Синдром полиагглютинабельности эритроцитов. Указанный синдром диагностируется на основании агглютинации эритроцитов больного большинством донорских сывороток, независимо от групповой принадлежности. Эритроциты в этих случаях не агглютинируются аутологичной сывороткой самих больных, а также эмбриональной сывороткой из пупочного тяжа. Указанный синдром бывает как врожденным, так и приобретенным. Приобретенный синдром — следствие бактериальной интоксикации (Т-, Tk-, В-, Th- и VA-типы) или клональной мутации в гемопоэтическом ряду (Тп-тип). Причиной описываемой аномалии является обнажение под влиянием вышеуказанных агентов скрытых антигенов (криптантигены). Наследственный синдром полиагглютинабельности встречается крайне редко и обусловлен мембранопатией с экспрессией на эритроцитах антигенов, в норме не встречающихся (HEMPAS-, Cad- и NOR-типы). Наиболее подробно в последней группе описан HEMPAS-синдром. Это редкая наследственная патология эритроцитов, сопровождающаяся повышенной чувствительностью последних к комплементу. Это так называемый HEMPAS-синдром — синдром многоядерных эритробластов. HEMPAS — аббревиатура названия заболевания на английском языке: hereditary erythroblastic multinuclearity with positive acid serum test. При данном заболевании имеет место положительный тест Хема, что требует дифференциальной диагностики с ПНГ. Следует упомянуть, что в большинстве случаев полиагглютинабельность эритроцитов не сопровождается клиническими проявлениями ГА и диагностируется лишь с использованием панели лектинов (экстрактов семян) Arachis hypogaea, Salvia sclarea, Salvia horminum, Glycine soja.

Наиболее частой причиной преждевременного распада эритроцитов являются аутоиммунные гемолитические анемии (АИГА).

Выделяют следующие типы АИГА:

1. АИГА с неполными тепловыми агглютининами:

— идиопатическая,

— симптоматическая.

2. АИГА с полными холодовыми агглютининами:

— идиопатическая холодовая гемагглютининовая болезнь,

— симптоматическая.

3. Пароксизмальная холодовая гемоглобинурия (анемия Доната—Ландштейнера): острая и хроническая формы (ПХГ).

4. Гемолизиновая (с кислотными и тепловыми гемолизинами) форма АИГА.

При АИГА с неполными тепловыми и полными холодовыми агглютининами гемолиз преимущественно происходит в клетках СФМ, вне сосудистого русла. При пароксизмальной холодовой гемоглобинурии с двухфазными антителами (анемия Доната—Ландштейнера) и гемолизиновых формах АИГА имеет место внутрисосудистый (внеклеточный) гемолиз. Однако в клинической практике указанная граница может быть нечеткой. Так, при первых двух типах АИГА в случае интенсивного гемолиза, обусловленного высокой концентрацией антител, происходит активация всего каскада комплемента, что приводит к образованию терминального комплекса С5—С9 и лизису эритроцитов в сосудистом русле. Все гемолитические трансфузионные реакции также протекают по внутрисосудистому типу.

Характерными клиническими особенностями внутрисосудистых гемолитических кризов являются эпизоды выделения черной мочи, зачастую сопровождающиеся абдоминальными коликами. Наиболее опасными являются тромбозы, сопровождающие течение хронических гемолитических процессов. У этих больных отмечается повышение уровня свободного НЬ плазмы и наличие гемосидеринурии. Так как свободный НЬ плазмы до фильтрации его почками связывается с гаптоглобином, отмечается снижение уровня последнего в сыворотке крови. Кроме того, важным этапом в развитии учения о гемолитических процессах явилось открытие R. H. Ham кислотного теста, называемого тестом Хема. Суть пробы заключается в лизисе исследуемых эритроцитов донорской сывороткой (точнее, имеющейся в ней системой белков комплемента) при подкислении среды. Положительные результаты пробы являются патогномоничными для ПНГ и HEMPAS. В то же время разработаны также прямая и перекрестная сахарозные пробы, проведение которых также необходимо при дифференциальной диагностике ПНГ и гемолизиновых форм АИГА, что зачастую невозможно. Метод прямой сахарозной пробы аналогичен таковому в тесте Хема. Суть же перекрестной сахарозной пробы — в инкубации донорских эритроцитов с исследуемой сывороткой. При наличии резко выраженной перекрестной сахарозной пробы при более слабых прямой сахарозной и пробе Хема наиболее вероятно наличие у больного гемолизиновой формы АИГА.

Наиболее распространенными формами АИГА являются: 1) АИГА с неполными тепловыми агглютининами, 2) АИГА с полными холодовыми агглютининами.

АИГА с неполными тепловыми агглютининами. Это — наиболее часто встречающаяся форма аутоиммунных гемолитических процессов. Заболевание может быть как идиопатическим, т. е. без явной первопричины, так и симптоматическим. Симптоматические, или вторичные, АИГА — следствие множества патологических процессов, наиболее частыми из которых являются лимфопролиферативные заболевания и другие злокачественные опухоли, болезни соединительной ткани, инфекционные болезни, различные аутоиммунные расстройства (неспецифический язвенный колит, аутоиммунный тиреоидит, пернициозная анемия, сахарный диабет I типа, саркоидоз и др.). В периферической крови отмечаются нормохромная анемия, ретикулоцитоз с выходом в кровь (при более острых формах гемолиза) нормобластов. При морфологическом исследовании костного мозга выявляют раздражение красного ростка.

Зачастую в крови обнаруживают большое количество микросфероцитов, что требует проведения дифференциальной диагностики с наследственным микросфероцитозом.

Основным иммунологическим методом, остающимся по сей день решающим в диагностике этой формы АИГА, является прямая проба Кумбса, или антиглобулиновая проба (АГП), суть которой состоит в том, что при наличии на поверхности эритроцитов неполных тепловых агглютининов добавление антиглобулиновой сыворотки (АГС) дает положительную осадочную реакцию на плоскости.

В настоящее время в результате работ многих исследователей (R. Sokol, G, Garratty, J. Leddy и др.) показано, что при тепловой форме АИГА (как идиопатических, так и симптоматических ее вариантах) антитела направлены к системе антигенов Rh. В более редких случаях элюаты антител с поверхности эритроцитов больных имели специфичность в отношении других групповых антигенных систем (Kell, Duffy, Wr, Lu, MNSs и др.).

Однако применение прямой пробы Кумбса имеет существенные ограничения. Показано, что минимальная разрешающая способность пробы составляет приблизительно 100—500 молекул IgG на эритроцит, в то время как при меньшей концентрации антител АГП будет отрицательной. Кроме того, недостаточное отмывание эритроцитов приводит к тому, что на поверхности эритроцитов остаются неотмытые молекулы сывороточных Ig, которые могут нейтрализовать АГС. Отрицательная АГП может быть следствием диссоциации с поверхности эритроцитов антител низкой аффинности в процессе отмывания. Кроме того, необходимо при проведении АГП принимать во внимание тип используемой АГС. АГС могут содержать как анти-IgG-антитела, так и антитела к СЗ-компоненту комплемента. Существуют также моновалентные сыворотки, специфичные к строго определенному классу и типу Ig. Учитывая все вышесказанное, на протяжении последних 20 лет внимание исследователей было сосредоточено на разработке методов, обладающих большей чувствительностью и специфичностью, чем проба Кумбса.

В последние 5 лет работы большинства исследователей в области АИГА направлены на оценку возможности использования и внедрения в клиническую практику иммуноферментного анализа (ELISA— enzyme— linked antibody test). Основными работами в этой области являются исследования группы R. J. Sokol и соавт. Этот метод позволяет количественно определить содержание Ig на поверхности одного эритроцита. С использованием моноклональных антисывороток, направленных к IgG, IgA, IgM, появилась возможность качественной оценки антиэритроцитарных антител.

В последние 2 года в широкую клиническую практику в странах Западной Европы и США вошел так называемый "гелевый" тест (gel test). Он основан на использовании геля, состав которого разработан швейцарской компанией "Diamed". Функцией геля является отделение эритроцитов от плазмы: Методика включает использование набора пластиковых диагностикумов для одноразового использования, в которые в зависимости от диагностических целей заранее нанесены соответствующие реактивы. Реактивами являются моноспецифические антитела к выявляемым антигенам. При АИГА принцип метода аналогичен выполнению прямой пробы Кумбса. Антигеном являются фиксированные на поверхности эритроцитов антитела и комплемент. Соответственно для выявления антител используют диагностикумы, в которые нанесены антитела к различным классам и подклассам Ig и фракциям комплемента. Проба — качественная; при сенсибилизации эритроцитов после центрифугирования в соответствующих роторах (лунки которых строго соответствуют форме пластиковых диагностикумов) образуются кольца преципитации антигена с антителом. Проба не требует отмывания эритроцитов, так как гель отделяет эритроциты от плазмы. Гелевый тест существенно чувствительнее прямой пробы Кумбса, так как при отмывании эритроцитов теряется часть Ig, фиксированных на поверхности эритроцитов.

Гелевый тест используется не только для диагностики АИГА, но и для выявления аллоантител в сыворотке крови, которые могут иметь место при множественных трансфузиях, иммунизации матери эритроцитами плода при несовместимости по системе Rh и другим групповым системам. Указанную пробу можно использовать и для диагностики ПНГ, применяя соответствующие диагностикумы с нанесенными моноклональными антителами к белкам, дефицит которых имеет место при ПНГ (см. выше). Используя антитела к антигенам вируса гепатита В и С, можно проводить диагностику вирусных гепатитов. Таким образом, гелевый тест прост в выполнении и достаточно чувствителен и специфичен. Можно с полным основанием утверждать, что в скором будущем он найдет широкое применение в диагностических целях.

АИГА с полными холодовыми агглютининами. Это заболевание принято называть холодовой гемагглютининовой болезнью (ХГАБ). Хотя описаны идиопатические формы ХГАБ, однако наиболее часто процесс является вторичным. В молодом возрасте ХГАБ обычно осложняет течение острой микоплазменной пневмонии и разрешается по мере купирования последней. У пожилого контингента больных холодовый гемолиз сопутствует хроническим вялотекущим лимфопролиферативным заболеваниям, протекающим с секрецией парапротеина IgM. который в большинстве случаев и играет ведущую роль в гемолитическом процессе. Наиболее часто ХГАБ сопровождает макроглобулинемию Вальденстрема и хронический лимфолейкоз с секрецией IgM, а также системные заболевания соединительной ткани.

Макроглобулин, обладающий свойствами холодовых агглютининов, благодаря своей высокой молекулярной массе вызывает гипервискозный синдром со всеми вытекающими отсюда последствиями. Заболевание проявляется симптоматикой Рейно. IgM функционирует при низких температурах, оптимальной для действия макроглобулина является температура +4°С. Поэтому весь симптомокомплекс заболевания разыгрывается на холоду, при переохлаждении открытых частей тела,

Для ХГАБ характерна панагглютинация эритроцитов больного со стандартными сыворотками при обычной комнатной температуре, что затрудняет серологические пробы на определение групп крови по системам АВО и Rh. В связи с этим указанные исследования производят при подогреве образцов крови (кровь берут в пробирку, предварительно опущенную в горячую воду). Последнее обстоятельство затрудняет также подбор донорской крови больным ХГАБ при необходимости проведения гемотрансфузий по витальным показаниям. При проведении плазмаферезов таким больным при лечении гипервискозного синдрома необходимо взятие крови проводить в предварительно подогретые системы "Гемакон".

В сыворотке крови таких больных обнаруживают диагностически значимое повышение титра холодовых антител. Как правило, при использовании поливалентной АГС прямая проба Кумбса оказывается в ряде случаев положительной за счет наличия в составе АГС антител к СЗ-компоненту комплемента. При использовании моновалентной АГС, содержащей лишь анти-IgG-антитела, АГП отрицательна. При применении метода ELAT на поверхности эритроцитов удастся выделить IgM. Полные холодовые агглютинины имеют специфичность к системе антигенов li на поверхности эритроцитов, в более редких случаях — к антигену Рг, разрушающемуся при обработке эритроцитов протеолитическими ферментами.

Материалы для контроля за усвоением темы:

Тестовый контроль:

1. При какой из гемолитических анемий может выявляться гипохромия эритроцитов:

a) наследственном микросфероцитозе;

b) талассемии;

c) аутоиммунной;

d) при дефиците глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

2. При дифференциальной диагностике наследственного микросфероцитоза (болезнь Минковского—Шоффара) и доброкачественной гипербилирубинемии основным диагностическим признаком является:

a) уровень билирубина;

b) общее состояние больного;

c) уровень гемоглобина;

d) морфология эритроцитов.

3. При диагнозе аутоиммунной гемолитической анемии основным дифференциальным признаком является:

a) уровень гемоглобина;

b) морфология эритроцитов;

c) показатели пробы Кумбса;

d) возраст больного.

Ответы: 1-b; 2-d; 3-c.

Задания для самоподготовки и УИРС:

1. Классификация гемолитических анемий.

2. Клинико-лабораторные показатели внутриклеточного и внутрисосудистого гемолиза.

3. Этиопатогенез и клинико-лабораторная диагностика наследственных гемолитических анемий, обусловленных изменениями мембраны эритроцитов.

4. Этиопатогенез и клинико-лабораторная диагностика наследственных гемолитических анемий, обусловленных изменениями активности ферментов.

5. Этиопатогенез и клинико-лабораторная диагностика наследственных гемолитических анемий, обусловленных нарушением синтеза гемоглобина.

6. Этиопатогенез и клинико-лабораторная диагностика пароксизмальной ночной гемоглобинурии (болезнь Маркиафавы – Микели).

7. Этиопатогенез и клинико-лабораторная диагностика приобретенных гемолитических анемий.

8. УИРС: Гемолитическая болезнь новорожденных.

Литература:

Основная

1. Медицинские лабораторные технологии (под ред. А.И. Карпищенко). – Санкт-Петербург: Интермедика, 1998. – т.1, с.287.

2. Справочник по гематологии (под ред. А.Ф.Романовой). –К.: Здоровье,1997. –с.74-103.

3. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования (под ред. Е.А. Кост). – М.: «Медицина», 1975. – с.179.

4. Фред Дж. Шиффман Патофизиология крови – М. – СПб.: «Издательство БИНОМ» – «Невский Диалект», 2000.-с.101-115.

Дополнительная

1. Гольдберг Е.Д. Справочник по гематологии с атласом микрофотограмм. Томск: Изд-во Том. Ун-та, 1989. – 468 с.

2. Вуд М., Банн П. Секреты гематологии и онкологии. – М.: «Издательство Бином», 1997. –560 с.