Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Литература / Руководство По Вирусологии

.pdf
Скачиваний:
772
Добавлен:
19.06.2017
Размер:
103.95 Mб
Скачать

1.1. ВВЕДЕНИЕ В ВИРУСОЛОГИЮ

99

 

 

а представлен единой макромолекулой нуклеиновой кислоты, данные о том, что небольшая часть вирусного потомства при смешанной инфекции может содержать гены как одного, так

идругого вируса-родителя, были первым указанием на образование рекомбинантных геномов. Такие наблюдения были сделаны в отношении как РНК-содержащих, так и ДНК-содержащих вирусов. Была отмечена различная частота образования рекомбинантов при скрещивании разных пар мутантов, что указывало на корреляцию частоты рекомбинации с расстоянием в геноме между мутациями. Это наблюдение послужило основой для составления генетических карт. С начала 1980-х годов стали появляться прямые молекулярно-биологические доказательства наследования генетической информации от двух вирусов-родителей по данным секвенирования нуклеиновых кислот [2].

Кнастоящему времени реассортация описана для всех РНК-содержащих вирусов с сегментированным геномом, включая негативно-ни- тевые вирусы (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae), амбисенс-вирусы (Arenaviridae, Phlebovirus

из Bunyaviridae), и вирусы с геномом, представленным дцРНК (Reoviridae). Рекомбинация зафиксирована и детально исследована у многих семейств ДНК-содержащих вирусов

иу большинства семейств РНК-содержащих вирусов, имеющих несегментированный геном. У вирусов с сегментированным геномом, помимо реассортации, возможна и настоящая рекомбинация. Она описана для хантавирусов (Вunyaviridae) и весьма вероятна у вирусов гриппа, у которых пока не рассмотрена рекомбинация между двумя вирусами в пределах одного геномного сегмента, но показан обмен генетическим материалом между разными сегментами одного и того же вируса, что указывает на существование механизма, способного осуществить истинную рекомбинацию (а не только реассортацию) между разными вариантами вируса гриппа.

Среди РНК-содержащих вирусов рекомбинация наиболее полно исследована на модели полиовируса. Опыты двух- и трехфакторного скрещивания мутантов полиовируса выявили аддитивность частот рекомбинаций по из-

бранным парам признаков, что позволило расположить эти признаки в линейном порядке и построить генетическую карту вируса. Сама возможность образования жизнеспособных рекомбинантов указывала на точность рекомбинации, т.е. на образование рекомбинантных геномов без выпадений (делеций) или вставок. Для объяснения такой точности рекомбинационного события была выдвинута гипотеза рекомбинации по механизму смены матриц [8]. Эта модель предполагает, что при синтезе комплементарной цепи РНК сначала в качестве матрицы используется одна молекула РНК, а затем RdRp вместе с синтезированным начальным участком РНК переходит на другую РНК-матрицу, на которой и завершается синтез рекомбинантной молекулы РНК. Очевидно, что согласно этой модели для рекомбинации обязательно нужна репликация РНК. Действительно, необходимость репликации для образования рекомбинантов была показана. Было также продемонстрировано влияние мутаций в гене вирусной RdRp на эффективность рекомбинации. Поэтому механизм смены матриц признаётся основной моделью, по которой происходит образование рекомбинантов у РНК-содержащих вирусов. Однако недавние исследования, выполненные сначала на модели РНК-содержащих фагов [5], а затем для полиовируса [1], показали, что возможны и другие механизмы. Оказалось, что инициировать инфекцию можно двумя фрагментами вирусной РНК, соответствующими молекуле вирусной РНК с разрывом в области гена полимеразы. Для того чтобы такие фрагменты инициировали инфекцию, они должны в клетке соединиться в единую молекулу, что указывает на способность клеточных РНК-лигаз соединять фрагменты вгРНК. Эти данные указывают на возможность использования полиовирусом нерепликативного механизма рекомбинации. Аналогичные данные были получены для вирусов рода Pestivirus сем. Flaviviridae. Тем не менее основным механизмом рекомбинации у пози- тивно-нитевых вирусов по-прежнему считают смену матриц.

Вирусы сем. Retroviridae (геном у них в вирусной частице представлен РНК, но репро-

100

 

Часть I. ВИРУСЫ

дукция включает стадию, на которой вирусная

гую приводит к мозаичной структуре реком-

генетическая информация присутствует в клет-

бинантной ДНК. Поэтому у ретровирусов не

ке в виде ДНК) тоже используют для реком-

наблюдается зависимости между расстоянием

бинации механизма смены матриц. Вирусы

между мутациями в геноме и частотой реком-

этого семейства содержат в составе вирусной

бинации по определённому маркеру в отличие

частицы фермент — обратную транскрипта-

от полиовируса, у которого вероятность реком-

зу (ОТ), который проникает в клетку вместе

бинацонного события низка и, как правило, при

с вгРНК и осуществляет в цитоплазме синтез

одном акте репликации происходит не более

вирусоспецифической ДНК, используя гДНК

чем одна смена матриц.

в качестве матрицы. Именно на этой стадии

Вирусы, геном которых представлен ДНК,

происходят рекомбинационные события. Ге-

используют при рекомбинации (в отличие от

ном вирусов сем. Retroviridae диплоидный, т.е.

РНК-содержащих вирусов) те же механизмы,

в каждой вирусной частице содержатся две

лежащие в основе перестроек клеточного гено-

молекулы вгРНК. ОТ начинает синтез ДНК

ма. Это прежде всего механизм разрыва и вос-

на одной из них, вблизи от 5 -конца. Дойдя до

соединения двунитевой ДНК.

5 -конца, она переходит вместе с новосинтези-

Первыми семействами ДНК-содержащих

рованным участком ДНК на другую молекулу

вирусов, у которых рекомбинация была заре-

гРНК и транскрибирует её, начиная с 3 -кон-

гистрирована, а затем детально проанализи-

ца. Таким образом, у вирусов этого семейства

рована, были сем. Аdenoviridae, Нerpesviridae

смена матриц является частью естественного

и Рoxviridae. Для этих семейств наиболее полно

механизма обычной репликации, а не толь-

описаны феноменология и механизмы ДНК-ре-

ко молекулярной основой рекомбинации, как

комбинации.

у полиовируса. Эта особенность придаёт ретро-

Важную роль в исследовании рекомбинации

вирусам высокую способность к образованию

сыграло обнаружение образования рекомби-

рекомбинантов при смешанной инфекции. Для

нантов между аденовирусом и вирусом SV40,

рекомбинации у ретровирусов необходимы два

относящимся к сем. Polyomaviridae, т.е. двумя

цикла репродукции. На первом цикле в резуль-

неродственными ДНК-содержащими вируса-

тате смешанной инфекции образуются вирус-

ми [9]. Присутствие части генома вируса SV40

ные частицы, у которых в диплоидном геноме

в вирусных частицах аденовируса 7 было снача-

каждая из двух молекул вгРНК получена от

ла выявлено по косвенным признакам, причём

разных вирусов-родителей. На втором цикле

первоначально предполагали, что в препаратах

репродукции ОТ при синтезе ДНК может не-

вируса содержится ДНК SV40, заключенная

сколько раз перейти с одной геномной РНК-

в аденовирусный капсид. Однако оказалось,

матрицы на другую, образуя рекомбинантную

что имеет место рекомбинация, при которой

нить ДНК. Сигналом для таких переходов

участок аденовирусной ДНК замещён отрез-

могут служить разрывы в полинуклеотидной

ком ДНК SV40, соответствующей 75% генома

цепи гРНК, а также участки замедления или

этого вируса. В дальнейшем были получены

остановки ОТ, сигналами для которых явля-

разнообразные рекомбинанты с участками аде-

ются участки РНК с выраженной вторичной

новирусной ДНК и ДНК SV40 в разных соот-

структурой. Возможны и прямые переходы на

ношениях и разной локализации, в том числе

другую матрицу, не зависящие от разрывов или

недефектные вирусные частицы, содержавшие

сигналов приостановки синтеза. Такие перехо-

полный геном аденовируса и участок генома

ды могут возникать в результате образования

SV40. Рекомбинанты аденовируса с SV40 на-

дуплексов между комплементарными участка-

шли широкое применение при картировании

ми новосинтезированной ДНК и второй (не-

геномов обоих вирусов.

транскрибируемой в данный момент) молеку-

Не менее большое значение для исследо-

лой гРНК [10]. Высокая частота актов перехода

вания структуры аденовирусного генома име-

транскриптазы с одной РНК-матрицы на дру-

ло получение рекомбинантов между разными

1.1. ВВЕДЕНИЕ В ВИРУСОЛОГИЮ

 

101

аденовирусами. Впервые возможность такой

вирусов протекает в клеточном ядре. Она на-

рекомбинации была показана А.Д. Альтштей-

чинается с циркуляризации линейной вгДНК,

ном и соавт. (1968), доказавшими возможность

после чего кольцевой геном служит матрицей

реассортации между аденовирусами человека

для синтеза новых гДНК, осуществляемого по

и обезьян. В дальнейшем для исследования

типу «катящегося кольца», в результате чего

структуры аденовирусного генома было приме-

образуется очень большая конкатемерная ДНК,

нено двухфакторное скрещивание между ts-му-

содержащая много геномных последователь-

тантами аденовируса 5. У ts-мутантов аденови-

ностей, ковалентно связанных «конец в конец».

русов корреляция между частотой рекомбина-

Некоторые из этих конкатемерных структур

ции и расстоянием между мутациями в гДНК

могут быть не линейными, а ветвистыми. Кон-

выражено достаточно чётко, но эта корреляция

катемеры разрезаются на отдельные геномные

характерна у аденовирусов только для точеч-

ДНК. Инверсия взаимной ориентации участков

ных мутантов, к которым относятся по боль-

генома, осуществляемая посредством разрывов

шей части ts-мутанты. У мутантов, имеющих

и воссоединений ДНК на участках инвертиро-

делеции и вставки, эта корреляция нарушена,

ванных повторов, происходит уже на стадии

что связывают с изменением частоты ошибок

образования конкатемерных структур [11].

ДНК-полимеразы, ведущих к актам рекомбина-

При смешанной инфекции этот процесс ведёт

ции, в области делеций и вставок. Рекомбина-

образованию рекомбинантных вирусов. Такая

ция у аденовирусов тесно связана с процессом

рекомбинация осуществляется по механизму

репликации ДНК, при котором у вирусов этого

гомологичной рекомбинации, требующей зна-

семейства одна из цепей дцДНК вытесняется

чительного сходства последовательностей ДНК

из дуплекса новообразованной нитью. Эта вы-

скрещиваемых вирусов области рекомбинаци-

тесненная оцДНК может связываться с комп-

онного события. Поэтому между близкород-

лементарными участками в районе расплета-

ственными вирусами (например, разными

ния нитей реплицирующейся ДНК, что и ведёт

штаммами вируса герпеса человека, HSV-1) она

к обмену участками генома, причём в процессе

идёт с высокой частотой (до 30%). Между более

разрыва и восстановления связей принимают

отдалённо родственными вирусами (например,

участие репарационные механизмы клетки [6].

HSV-1 и HSV-2) рекомбинации происходят

У большинства вирусов сем. Herpesviridae

с намного меньшей частотой, а между ещё более

(в частности, у всех вирусов подсем. Alphahe

отдалёнными, такими, как герпесвирус круп-

rpesvirinae) рекомбинация является необхо-

ного рогатого скота 1 (ВоНV-1) и герпесвирус

димым компонентом процесса репликации

коз 1 (СрНV-1), не наблюдаются совсем. Од-

генома. В отличие от ретровирусов, у кото-

нако гомологичная рекомбинация, в механизме

рых связь репликации с рекомбинацией обус-

которой важную роль играет сходство последо-

ловлена использованием механизма смены

вательности нуклеотидов в ДНК вирусов-ро-

матриц при репликации, у многих вирусов

дителей, не является единственным типом ре-

сем. Herpesviridae в линейной дцДНК имеются

комбинации у Herpesviridae. Наблюдается, хотя

два участка, L и S, находящиеся в разных моле-

и со значительно меньшей частотой, и негомо-

кулах ДНК в различной взаимной ориентации.

логичная (или «незаконная») рекомбинация,

Между участками, а также на конце участка S

при которой гомология нуклеотидных после-

имеются инвертированные повторы — соот-

довательностей не имеет значения. Сопоставле-

ветственно внутренний (IR) и концевой (TR).

ние нуклеотидных последовательностей ДНК

Именно наличие повторов обеспечивает осу-

разных герпеcвирусов показывает, что оба типа

ществление инверсий взаимной ориентации

рекомбинации (гомологичная и негомологич-

участков L и S в ходе репликации ДНК, причём

ная) сыграли существенную роль в эволюции

эти инверсии происходят в результате актов

вирусов этого семейства [12].

рекомбинации между инвертированными пов-

У вирусов сем. Рoxviridae репликация осу-

торами [12]. Репликация генома альфагерпес-

ществляется в цитоплазме. Это ограничивает

102

Часть I. ВИРУСЫ

 

 

возможности участия клеточных механизмов

впроцессах рекомбинации. Рекомбинация у Рoxviridae возникает в результате образования гетеродуплексов, причём отсутствие процесса репарации в цитоплазме повышает вероятность того, что формирование гетеродуплекса приведёт к рекомбинации. Молекулярный механизм рекомбинации у Рoxviridae тесно связан с инициацией репликации, которая у вирусов этого семейства начинается со сложной перестройки конца линейной молекулы ДНК. У Рoxviridae две цепи ДНК соединены на конце дуплекса ковалентной связью, и в концевой области имеется несколько прямых повторов. Для начала репликации необходимо возникновение разрыва в одной из нитей ДНК в районе повторов, приводящее к разворачиванию концевой шпильки и удлинению дуплекса путём достройки второй нити на развернутом участке. В дальнейшем в этом районе образуется репликативная вилка. Именно на начальной стадии репликации возможно образование гетеродуплекса, ведущее к получению рекомбинантного генома [7].

Реассортация, характерная для вирусов с сегментированным геномом, не требует в отличие от рекомбинации образования геномных структур, содержащих ковалентно связанные участки генома разных вирусов. Поэтому, будучи в чисто генетическом аспекте явлением, близким к рекомбинации, она имеет совершенно иной молекулярный механизм, связанный не с репликацией, а со сборкой вирусной частицы на поздней стадии инфекции. Для вирусов сем. Orthomyxoviridae и Reoviridae, геном которых представлен значительным количеством сегментов, подбор сегментов в состав вирусной частицы является высокоупорядоченным процессом, обеспечивающим присутствие только одной копии каждого сегмента в вирусной частице. Механизм, лежащий в основе взаимного распознавания сегментов при сборке, не вполне ясен, но само распознавание и его высокая точность продемонстрированы достаточно убедительно. Для вирусов гриппа показано, что

враспознавании участвуют концевые участки РНК-сегментов длиной 100–180 н.о., включающие как некодирующий участок сегмента, так

иначальную часть кодирующей последовательности. При смешанной инфекции, вызванной двумя близкими вариантами вируса гриппа А, продуцируемая популяция вируса содержит набор реассортантов с весьма разнообразными сочетаниями генов, унаследованных от того или другого вируса-родителя. Вероятность попасть в состав формирующегося вируса может несколько варьировать для разных сегментов, унаследованных от того или другого вируса-ро- дителя, но она всегда достаточно высока [13]. Поэтому популяция вируса при смешанной инфекции содержит набор реассортантов с весьма разнообразными сочетаниями генов, полученных от того или другого вируса-родителя. Это не значит, что все реассортанты будут одинаково жизнеспособными. Хотя каждый сегмент вгРНК может оказаться включенным в состав вируса, далеко не каждое сочетание генов благоприятно, поскольку белки, кодируемые этими генами, могут быть функционально не вполне совместимы. Так, у вирусов гриппа А гликопротеины вирусной оболочки — гемагглютинин

инейраминидаза — должны иметь определённое функциональное соответствие в отношении сродства гемагглютинина к клеточным рецепторам и ферментативной активности нейраминидазы. Реассортанты, у которых эти белки не вполне подходят друг другу, поскольку их гены получены от разных родителей, имеют низкий уровень репродукции [3]. Такие ограничения могут иметь большое значение в природных условиях, поскольку реассортация лежит в основе появления новых антигенных вариантов вируса гриппа А, в том числе вызывающих глобальные эпидемии (пандемии).

Литература

1.Агол В.И., Гмыль А.П. Многообразие механизмов РНК-рекомбинации // Молек. биол. — 2005. — Т. 39. — С. 618–632.

2.Романова Л.И., Викторова Е.Г., Тольская Е.А. и др.

Первичная структура области перекреста в геноме двух межтиповых рекомбинантов полиовируса // Биоорганическая химия. — 1985. — Т. 11. — С. 1685–1687.

3.Руднева И.А., Ильюшина Н.А., Шилов А.А. и др.

Функциональные взаимодействия между гликопротеинами вируса гриппа // Молекулярная биология. — 2003. — Т. 37. — С. 34–40.

1.1. ВВЕДЕНИЕ В ВИРУСОЛОГИЮ

103

 

 

4.Altstein A.D., Dodonova N.N., Vassilieva N.N. et al.

Hybrid of monkey and human adenoviruses // J. Virol. — 1968. — V. 2. — P. 488–493.

5.Chetverin A.B. The puzzle of RNA recombination // FEBS Lett. — 1999. — V. 460. — P. 1–5.

6.Domingo E. Virus evolution // In Fields Virology, 5th edition / Eds. D.M. Knipe, P.M. Howley. — Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 2007.

7.Epstein L.H., Young C.S. Adenovirus homologous recombination does not require expression of the imme- diate-early E1a gene // J. Virol. — 1991. — V. 65. —

P.4475–4479.

8.Fisher C., Parks R.J., Lauzon M.L. et al. Heterologous DNA formation associated with the replication and replication in poxvirus-infected cells // Genetics. — 1991. — V. 129. — P. 7–18.

9.Kirkegaard K., Baltimore G. The mechanism of recombination in poliovirus // Cell. — 1986. — V. 47. —

P.433–443.

10.Lewis A.M. SV40 in adenovirus vaccines and ade- novirus-SV40 recombinants // Dev. Biol. Stand. — 1998. — V. 94. — P. 207–216.

11.Negroni V., Buc H. Mechanisms of retroviral recombination // Ann. Rev. Genet. — 2001. — V. 35. —

P.275–302.

12.Thiry E., Meurens F., Muylkens B. et al. Recombination in alphaherpesviruses // Rev. Med. Virol. — 2005. —

V.15. — P. 89–103.

13.Umene K. Mechanism and application of genetic recombination in herpesviruses // Rev. Med. Virol. — 1999. — V. 9. — P. 171–182.

14.Varich N.L., Gitelman A.K., Shilov A.A. et al. Deviation from the random distribution pattern of influenza A virus gene segments in reassortants produced under non-selective conditions // Arch. Virol. — 2008. —

V.153. — P. 1149–1154.

1.1.7.Взаимодействие

вирусов с клетками

(Жирнов О.П.)

Взаимодействие вируса с клеткой составляет одну из фундаментальных проблем вирусологии и лежит в основе понимания многих механизмов патогенеза вирусных болезней. В этом взаимодействии можно выделить три основных процесса. Во-первых, это процесс репликации вируса и его способность гармонично использовать клеточные механизмы для своего размножения. Его изучение способствует пониманию не только вирусологических, но и базовых биологических механизмов и их регуляции.

Во-вторых, процесс дисрегуляции клеточного метаболизма, который возникает под влиянием вируса и может развиваться по типу трансформации или повреждения и истощения и приводить либо к трансформации и имортализации, либо, наоборот, к гибели клеток соответственно. Этот процесс определяет исход вирусного инфицирования клетки и лежит в основе развития патологического процесса; познание его механизмов позволяет понять, каков патогенез болезни и вирусоспецифических поражений при размножении вируса в различных тканях

иорганах. В-третьих, взаимодействие вируса с клеткой вызывает программированную клеточную защитную реакцию, которая направлена против вируса для спасения инфицированной клетки и соседних с ней клеток. При этом отмечают ещё и четвёртый процесс: в ходе эволюции вирусы выработали контрмеханизмы не только для блокирования различных этапов этой клеточной реакции, но и её использования для усиления своего размножения. Исход такого противостояния клетки и вируса определяет тяжесть заболевания и отражает патогенный потенциал вируса. Таким образом, выделяют четыре главных направления (которые далее будут рассмотрены подробно) в реализации вирус-клеточного взаимодействия: 1) внедрение вирусов в клетки-мишени и роль клеточных факторов; 2) механизмы вирусиндуцированной гибели клеток; 3) репликация вирусов

иклеточная аутофагия; 4) система ИФН и ви- рус-клеточное противостояние. Механизмы же блокирования апоптоза и способности клеток к неограниченному росту (иммортализация клеток) при трансформации опухолеродными вирусами можно проследить в обзоре E. White [32].

1.Внедрение вирусов в клетки-мишени

ироль клеточных факторов. Чтобы инфицировать клетку, вирус первоначально осуществляет поиск чувствительной клетки-мишени, прикрепляется к её поверхности и через многоступенчатый путь внедряется в неё. На этом пути вирус проходит её наружную плазматическую мембрану, освобождается от своей белковой (у икосаэдрических вирусов) или липидобелковой (у оболочечных вирусов) оболочки

104

Часть I. ВИРУСЫ

 

 

(процесс «раздевания») и транспортирует свой генетический аппарат (ДНК или РНК) к определённому клеточному компартменту — сайту репликации вирусного генома. На каждом этапе этого маршрута вирус использует тот или иной клеточный механизм и специфическим для вируса способом интегрируется в него для выполнения своей программы внедрения в клетку и инициации инфекции.

Первый этап взаимодействия вируса с клеткой — это адсорбция вируса на поверхности клеток. Вирусы распознают определённые структуры на клеточной поверхности и специфически прикрепляются к ним посредством своих специализированных рецепторных белков, расположенных на поверхности вирионов. Такая рецепторная специфичность лежит в основе избирательного заражения клеток определённого типа и регулирует клеточный тропизм вируса. Спектр клеточных структур, которые используются вирусами для адсорбции, довольно разнообразен и включает белки, углеводные структуры и гликолипиды. Эти структуры очень часто выполняют акцепторную функцию для физиологических лигандов сигнальных клеточных путей, поэтому прикрепление к ним вируса может повреждать или активировать соответствующие биохимические пути и изменять метаболизм клеток. В качестве клеточных рецепторов вирусами используются белки CD4 (ВИЧ), HveA (герпесвирусы), ангиотензинконвертирующий фермент (тяжёлый острый респираторный синдром — ТОРС, вирус гастроэнтерита), белок клеточной адгезии JAM-1 (реовирусы), внутриклеточный адгезивный белок ICAM-1 (риновирусы), интегрины (эховирусы), CD46 (вирус краснухи), CD55 (эховирусы, вирусы Коксаки В), CD155 (полиовирус), клеточный рецептор ламинина (вирус Синдбис), CAR (вирусы Коксаки А и В, аденовирусы), 3-интегрин (буньявирусы), рецептор фактора роста нейронов (вирус бешенства), -дистрогликан (аренавирусы) и др. [11]. Из углеводных соединений вирусы используют сиалосодержащие гликаны (вирусы гриппа, парамиксо-, парво-, полиомавирусы), сульфатированные производные гепарина (цитомегало- и герпесвирусы), галактозасодержащие гликаны (альтернативный ре-

цептор ВИЧ) и др. Так, например, вирусы гриппа А человека субтипов Н1–Н3 прикрепляются

кгликопротеидам с терминальным остатком сиаловой кислоты, присоединённым 2-6-свя- зью, тогда как вирусы гриппа птиц, в том числе

и вирусы субтипа H5N1, предпочитают сиалогликопротеиды с 2-3-типом связи. Поскольку эпителий носоглотки, трахеи и крупных брон-

хов человека обогащён сиалогликопротеидами2-6-типа, а лёгкие и бронхиолы — гликопротеидами 2-3-типа, обычные вирусы гриппа человека H1-H3 инфицируют преимущественно верхние отделы и легко передаются от человека

кчеловеку (например, при чиханьи), тогда как вирус птичьего гриппа H5N1 имеет сродство

книжнему отделу респираторного тракта, вызывая, как правило, бронхопневмонию и не использует при этом аэрозольный тип передачи от человека к человеку [26, 30].

Помимо начального поискового рецептора прикрепления ряд вирусов вовлекают дополнительные клеточные белки (т.н. корецепторы), которые входят в состав начального вирус-клеточ- ного комплекса и способствуют переходу фазы адсорбции вируса в необратимую фазу входа вируса в клетку. Так, например, для ВИЧ-1 фактором первичного распознавания служит маннозасвязывающий лектин типа С или ICAM-3- захватывающий неинтегриновый белок клеток печени или лимфатических узлов. Это начальное связывание вирусного рецепторного белка gp120 не изменяет его конформацию, однако дополнительное присоединение домена G рецептора CD4 индуцирует конформационную перестройку gp120, которая, в свою очередь, открывает доступ к корецепторам CXCR4 или CCR5 (хемокиновые рецепторы клеток) и запускает процесс слияния вирусной оболочки с мембраной клетки вирусным белком gp41. Сходная многокомпонентная адсорбция описана у альфагерпесвирусов, когда гепариновые протеогликаны инициируют прикрепление вируса к клетке, а уже другой вирусный белок, связываясь с клеточным интегрином или нектином, запускает процесс входа вируса в клетку через слияние с клеточной мембраной. Корецепторами в проникновении вируса Коксаки В в дополнение к главному рецептору — бел-

1.1. ВВЕДЕНИЕ В ВИРУСОЛОГИЮ

105

 

 

ку CAR — служат клеточные белки оклудин

иCD55 [9]. Возможно, вирус гриппа А при внедрении в клетку-мишень может использовать дополнительный клеточный корецептор, природа которого пока не установлена [1].

Другим важным элементом клеточной адсорбции вирусов является клеточный актин, микросеть которого формирует кортекс под плазматической мембраной клетки [9]. Этот апикальный кортекс служит противовирусным барьером, и вирусы различных семейств преодолевают его с помощью различных механизмов. После начального прикрепления к клетке вирус перемещается по её поверхности и собирает компоненты рецепторного комплекса,

иэтот процесс и последующее начало эндоцитоза осуществляются при участии микросети актина. Важно подчеркнуть, что апикальная актиновая сеть служит важным компонентом вирусного внедрения в клетку-мишень: её повреждение с помощью деполимеризирующих агентов типа цитохолазина В или латрункулина А ведёт к торможению вирусного входа в клетку-мишень. Актиновый кортекс имеет исключительно большое значение при инфекции клеток «поляризованного» эпителия в респираторном и кишечном тракте такими вирусами, как ротавирусы, вирусы гриппа, адено-, герпес-

икоксакивирусы и др. [9].

Особо следует отметить возможную роль антивирусных антител в усилении адсорбции вируса на клетках. Обычно такие антитела, направленные против вирусных рецепторных белков, обладают вируснейтрализующими свойствами и играют главную роль в протективном антивирусном иммунитете. Однако у некоторых вирусов, например вирус денге, ВЗН, вирус гриппа А, ВИЧ-1, 2, вирус Эпштейна—Барр, данные антитела могут связываться с вирионами в субнейтрализующих концентрациях или с ненейтрализующими эпитопами вирусных рецепторных белков и возникшие вирус-анти- тельные комплексы могут эффективно абсорбироваться клетками, несущими иммуноглобулиновые рецепторы. Такой опосредованный антителами процесс может усиливать диссеминацию вирусной инфекции и расширять тканевой тропизм вируса [2].

Второй этап — вход в клетку и «раздевание» вируса. После адсорбции вируса наступает фаза входа вируса в клетку. Эта фаза состоит из двух сцепленных между собой процессов: преодоления вирусом клеточного барьера плазматической мембраны и удаления защитной оболочки вируса и внутриклеточного высвобождения вирусного генома. Существует два принципиальных пути входа вирусов в клетку: посредством слияния вирусной оболочки и плазматический мембраны клетки на её поверхности (этот путь присущ ряду оболочечных вирусов) и посредством клеточного механизма рецепторного эндоцитоза, когда после адсорбции на клеточных рецепторах вирус инвагинируется участком плазматической мембраны и оказывается внутри эндоцитарной вакуоли, из которой он также выходит через слияние с клеточной мембраной (у оболочечных вирусов) или путём перфорации эндосомальной стенки (у безоболочечных вирусов) (рис. 1.1.72). Инвагинация вирусов на плазматической мембране может происходить в обогащённых клатрином углублениях («клатриновых ямках») либо в т.н. «плотиках», обогащённых холестеролом и содержащих кавеолин («кавеолы»). Первый путь внедрения характерен для парамиксо-, альфа-герпес-, ретровирусов (включая ВИЧ, вирус осповакцины и другие вирусы), тогда как большинство вирусов, таких как вирусы гриппа, полио-, адено-, рабдо-, тога- и др., используют эндоцитарный путь входа в клетку [23]. Некоторые вирусы, такие как вирус гриппа, полиомы и герпес-ви- рус, могут использовать и третий эндоцитарный путь, не связанный ни с клатрином, ни с кавеолином и пока малоизученный. Следует также отметить, что у большинства вирусов основная популяция частиц внедряется по одному из указанных путей, тогда как минорные фракции вируса могут входить в клетку по другим возможным путям, что, вероятно, обусловлено свойством вирусов связываться с различными типами клеточных рецепторов.

Указанные пути внедрения имеют свои особенности. Так, слияние на плазматической мембране происходит обычно при нейтральном рН питательной среды в клеточной культуре или физиологической жидкости в организме.

 

 

 

 

106

 

Цитоплазматическая

 

мембрана

 

Актиновый

 

 

цитоскелет

Кавеола

 

 

 

Эндосома

 

Эндосома

pH 6–6,5

Кавеосома

pH 6–6,5

 

pH нейтральный

 

 

Микро-

Э.Р.

 

трубочки

 

Эндосома

 

 

Эндосома

 

pH 5,0–6,0

pH 5,0–6,0

 

Часть I. ВИРУСЫ

 

 

Микротрубочки

Ядерная оболочка

А

Б

В

Рис. 1.1.72. Пути внедрения вирусов в клетки-мишени и роль клеточных факторов:

А — вирус гриппа (РНК-содержащий оболочечный вирус) проникает посредством рецепторного эндоцитоза, адсорбируясь с помощью своих белков НА и NA на сиалосодержащих рецепторах, далее — инвагинация в раннюю эндосому с рН около 6,0 и её трансформация в позднюю эндосому с рН 5,0, затем закисление вириона через вирусные ионные каналы М2, «раздевание» вируса и выход индивидуальных сегментов вирусного нуклеокапсида и их транспорт в ядра через ядерные поры; Б — вирус SV-40 (ДНК-содержащий безоболочечный вирус) прикрепляется к ганглиозидам в области «плотиков» плазматической мембраны, формирующих кавеолы, в которых фосфорилируются и реорганизуются актиновые нити, и они трансформируются в кавеосомы, далее кавеосомы с помощью динеина перемещаются по микротрубочкам в гладкий эндоплазматический ретикулум, в котором вирус «раздевается», и нуклеокапсид транспортируется в ядерные поры; В — аденовирус (ДНК-содержащий безоболочечный вирус) своими фибрилами распознаёт рецептор CAR на клеточной поверхности, и вирусный пентон взаимодействует с клеточным интегрином, индуцириует PI-3-киназу и локально перестраивает цитоскелетный кортекс, формируя клатриновую вакуоль, которая трансформируется в эндосому, где при кислом рН вирус перестраивается и выходит в цитоплазму и далее с помощью динеина по микротрубочкам перемещается к ядерной

поре, в устье которой происходит «раздевание» вируса, и уже его ДНК впрыскивается в ядро

При эндоцитозе слияние вирусной и клеточной мембран или перфорация последней происходят в эндосомах, имеющих кислый рН, который поддерживается клеточным АТФ-зависимым протоновым насосом на уровне 6,5–5,0 в различных зонах цитоплазмы клеток. Такое закисление вызывает активацию вирусных белков, ответственных за выход и раздевание вируса и, таким образом, служит сигналом начала данного поэтапного процесса. У некоторых вирусов (вирусы Эбола и ТОРС-ассоциированный коронавирус) процесс слияния требует участия протеаз, таких как катепсин L и В.

Способ вхождения в клетку тесно связан с механизмом «раздевания», или депротеини-

зации, вируса. Этот процесс имеет несколько этапов и контролируется в основном вирусными белками слияния (фузии). У оболочечных вирусов существует два класса таких белков, различающихся по механизму функционирования их фузионных пептидов [11]. Типичный представитель класса I — белок НА вируса гриппа А, имеющий терминальный пептид слияния, а типичные представители класса II — белки слияния флави- и альфавирусов, у которых сливающий пептид имеет интрамолекулярную локализацию. В результате слияния вирусной и клеточной мембран происходит раскрытие вириона и его внутренний нуклеокапсид, содержащий геномную нуклеиновую кислоту,

1.1. ВВЕДЕНИЕ В ВИРУСОЛОГИЮ

 

107

оказывается во внутриклеточном пространстве.

SV-40, индуцируя фосфорилирование актина,

У безоболочечных вирусов такой выход нукле-

вызывает диссоциацию актиновой микросети

окапсида осуществляется вирусными белками,

на стадии эндоцитоза, и, наоборот, при «разде-

которые делают локальный лизис или форми-

вании «бакуловируса его белок р78/83 вызы-

руют белковые поры в окружающей клеточной

вает асимметричную полимеризацию актина,

мембране. «Раздевание» вируса и выход нукле-

которая стимулирует его дальнейший путь по

окапсида — это запрограммированный процесс

микротрубочкам. Далее передвижение по мик-

кооперативных конформационных и функци-

ротрубочкам идёт к микротубулярному цитоп-

ональных превращений наружных вирионных

лазматическому центру (МТЦ) (ретроградный

белков, пусковым моментом которого служит

транспорт) либо непосредственным переносом

контакт вируса с клеточными рецепторами

самого генетического комплекса вируса, либо

и/или кислый рН эндосом. Так, например,

его транспортом в липидных везикулах. Из

у вируса гриппа А в этом процессе принимают

МТЦ вирусный генетический комплекс может

участие четыре белка — НА и NA, фузирующие

перемещаться в ядра, проходя ядерную мемб-

липидные мембраны вируса и эндосомы, белок

рану через ядерные поры. В ядерном транспор-

ионных каналов М2, направляющий поток про-

те вирусом используется клеточный аппарат

тонов для растворения белкового матрикса М1

т.н. «комплекса ядерных пор», движение в ко-

и освобождения индивидуальных сегментов

тором регулируется более чем 50-клеточными

вирионного рибонуклеопротеида. У безоболо-

белками-нуклеопоринами, а верхний пропус-

чечного полиовируса связывание с рецептором

кной лимит составляет 39 нм [2]. Обратное

белка VP4 приводит к его удалению из вирио-

движение вирусных компонентов к периферии

на и конформационному высвобождению гид-

клеток (антероградное направление), доми-

рофобной миристиловой группы белка VP1,

нирующее при сборке новых вирионов, также

формирующему каналы в эндосомальной мем-

идёт в основном по микротрубочкам, но этот

бране, через которые вирусная РНК выходит

маршрут обслуживается клеточным кинези-

в цитоплазму. После внутриклеточного высво-

новым мотором. Скорость внутриклеточного

бождения генетический аппарат у различных

движения вирусных компонентов молекуляр-

вирусов направляется либо в ядро, либо к спе-

ными клеточными моторами составляет около

цифическим везикулярным структурам (агрео-

1 мкм/с [15].

соммам) в цитоплазме.

Среди вирусов существует заметное разно-

Третий этап — внутриклеточные переме-

образие в механизмах внутриядерного транс-

щения вирусов. После интернализации вируса

порта. Мелкие нуклеокапсиды парвовирусов

и его «раздевания» генетический аппарат це-

(20 нм) и вируса гепатита В (38 нм) проходят

ленаправленно перемещается в цитоплазме

в ядра в интактной форме и уже дополнитель-

по цитоскелету, заимствуя клеточные молеку-

но дезинтегрируются внутри ядер. Нитевидные

лярные моторы. Диффузионное перемещение

нуклеокапсиды вируса гриппа А (20 нм) взаи-

надмолекулярных геномных комплексов виру-

модействуют с импортином и проходят в ядра

са в переполненной цитоплазме маловероят-

клеток в интактной форме. Более крупные ви-

но, так как оно возможно лишь для структур

русы, такие как аденовирус 2, последовательно

меньше 20 нм (соответственно менее 500 кДа).

связывают белок NUP214/CAN экстранукле-

В вирусном перемещении участвуют как мио-

арных филаментов и затем кариоферины и 7

зиновый мотор с актиновой микросетью, так

и гистона Н1, что вызывает диассамблирование

и динеин-актиновый мотор, ассоциированный

крупного нуклеокапсида на входе в ядерную

с микротрубочковыми путями. Микротубуляр-

пору, и уже свободная вгДНК входит в ядро.

ный цитоскелет связан с актиновым кортексом,

Нуклеокапсид вируса герпеса (120 нм) «при-

поэтому внутриклеточный путь у некоторых

чаливает» к ядерной поре через импортин

вирусов начинается при взаимодействии с ак-

и свободная вгДНК впрыскивается в ядро без

тиновыми филаментами. Так, например, вирус

распада нуклеокапсида. Внутриядерный транс-

108

Часть I. ВИРУСЫ

 

 

порт прединтегразного комплекса лентивируса ВИЧ-1 не требует ядерных пор и осуществляется на стадии митоза клеток, когда ядерная оболочка временно отсутствует, и контролируется вирусными белками МА, интегразой, vpr и элементом flap гДНК.

Особый механизм, получивший название трансцитоз, описан у ВИЧ и полиовируса. Физиологический трансцитоз — это механизм перемещения клеточных везикул с одной стороны клеток на другую без их изменения, характерный для многоклеточных организмов, транспортирующих молекулы между различными средами. Оказалось, что вирусы способны использовать этот транспортный путь для преодоления эпителиальных барьеров и инфицирования нижележащих тканей [7]. При этом вирусы в неизменном виде проходят клетки и инфицируют нижние клеточные слои либо путём прямого слияния с их мембранами, либо посредством прямого транспорта через межклеточные контакты, которые иногда называют как «вирусологические синапсы».

2. Механизмы вирусиндуцированной гибели клеток. Особая область взаимодействия вирусов с клетками касается рассмотрения процессов исхода вирусной инфекции и механизмов клеточной гибели. Только в последние несколько лет появилась значительная информация, проливающая свет на молекулярные механизмы терминальных стадий взаимодействия вируса и клетки. Различают два основных процесса клеточной гибели: апоптоз и некроз. Оба процесса запрограммированы в клетке и запускаются для физиологического самоочищения организма от старых, повреждённых или вредных клеток. Дополнительно выделяют самостоятельный процесс аутофагии (самопоедания), который направлен на устранение из клеток устаревших и вредных молекул. Однако его самостоятельность условна, так как в своей терминальной фазе он также приводит к апоптозу или некрозу. Сходные процессы программированной смерти индуцируются в клетках, заражённых различными вирусами, как правило, на поздних сроках инфекции. Пока нет единого мнения, является ли этот процесс собственной защитной реакцией клетки на вирус или это

есть процесс, индуцированный самим вирусом, для поддержания и/или стимулирования поздних этапов своей репродукции. Кодирование многими вирусами белков с антиапоптозными свойствами склоняет в пользу первой точки зрения. Помимо прямой активации некоторые вирусы, чтобы снизить защитную противовирусную реакцию, могут провоцировать массивный апоптоз иммунных клеток организма без их прямого инфицирования (такой процесс можно назвать трансапоптозом).

Указанные процессы гибели клеток имеют характерные сигнальные и биохимические пути, развитие которых, во-первых, приводит к появлению характерных морфологических признаков у погибающих клеток и, во-вторых, оказывает различное влияние на ответную фагоцитарную и воспалительную реакцию макроорганизма. Для апоптоза характерны сморщивание клеток, отсутствие признаков распада внутриклеточных органелл, кариопикноз ядер

иконденсация хроматина, расщеплённого на дискретные фрагменты, выход фосфотидилсерина (ФС) на поверхность плазматической мембраны, вакуолизация («пузырение») клеточной поверхности, которые в терминальной стадии приводят к распаду клеток на фрагменты (апоптозные тельца), окружённые участками неповреждённой плазматической мембраны. Процесс некроза характеризуется набуханием клеток и ядер, неспецифическим гидролизом хроматина и отсутствием активации каспаз, повреждением внутренней структуры клеток

ивакуолизацией цитоплазмы, набуханием митохондрий и их разрушением, повреждением плазматической мембраны и вытеканием внутреннего содержимого клетки. Для аутофагии характерна интенсивная цитоплазматическая вакуолизация клеток, обусловленная образованием множественных аутофагосом и их слиянием с лизосомами (вторичные лизосомы). Главными отличительными признаками апоптоза от некроза служат зависимость первого от АТФ, специфический выход ФС на поверхность клетки и отсутствие таковых при некрозе, а также выраженная способность некротических клеток вызывать тканевое воспаление и его отсутствие при апоптозе [6, 14]. Важно отметить, что фор-

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Оставленные комментарии видны всем.

Соседние файлы в папке Литература