Микробиологическая индикация ботулизма у больных и пищевых объектах:

В материалах:

- от больного (кровь, рвотные массы, кал. промывные воды желудка),

- из органов труппа (печень, желудок и кишечник с содержимым),

- в пищевых продуктах.

Цели лабораторной диагностики, обнаружение:

- ботулинического токсина и определение его типа;

-возбудителя ботулизма.

Методы исследования:

1. Микроскопический, ориентировочный (окраска по Граму, Ожешко).

2. Бактериологический, основной (в классическом и ускоренном вариантах) с учетом анаэробности.

3.Серологический, серо-биологический, косвенные.

Бактериологический метод исследования:

Правила отбора материала. Необходимо брать:

1. Кровь - до введения антитоксической сыворотки. Из вены 6-8 мл в стерильную пробирку, выдержать 20 мин при +37оС. Сгусток отделить от стенок пробирки. Исследовать сыворотку (можно брать кровь в пробирку с 4% раствором лимон­нокислого натрия в соотношении 3:1).

2. Промывные воды желудка - 50-100 мл.

3. Кал-50-60 мл.

4. Из трупов (стерильно!). Поверхность органа прижечь раскаленным шпателем, стерильными ножницами вырезать ткань из глубины органа: кусочки печени - 50-60, отрезки тонкого кишечника (с содержимым), кусочки легочной ткани (50-60), кровь-10 мл.

5. Продукты (не менее 100 мл): сырье для консервирования,

готовая продукция (рыбные, овощные, мясные консервы), остатки пищепродуктов, послуживших причиной отравления.

Примечание:

Каждый материала брать в отдельные, стерильные банки. Последние тщательно закрывать стерильными пробками, крышками.

Материал тщательно закрывать стерильными пробками и до исследования хра­нить на холоде, т.к. ботулинический токсин разрушается при комнатной темпе­ратуре.

Этапы бактериологического исследования:

1. Обнаружение и идентификация ботулинических токсинов:

- цитратную кровь, сыворотку без обработки используют для постановки реак­ции нейтрализации;

- кал (20-25) растереть в ступке с 50 мл физиологического раствора; выдержать при комнатной температуре 1-1,5 часа (для экстрагирования токсина эмульсию профильтровать через ватно-марлевый фильтр и использовать фильтрат в реак­ции нейтрализации;

- пищевые продукты растереть, экстрагировать в физиологическом растворе 1 час., фильтровать через ватно-марлевый фильтр (или центрифугировать при 3000 об/мин. 15-20 мин.).

- органы трупа - экстракты из тканей готовят аналогично (§ 1-3) и используют в реакции нейтрализации.

Реакция нейтрализации.

Для выполнения реакции необходимы:

- 4 мыши (вес 16-18 г),

- смесь противоботулиновых сывороток (типы А, В, С /С1, С2/, Е, Д. J. g, в ос­новном А, В, Е).

Опыт Контроль

0,5-0,8 мл фильтрата 0,5-0,8 мл фильтрата + 0,2 мл

(или центрифугата) смеси сывороток (по 0,01 мл

в/брюшинно каждого типа, содержащих от 50

до 400 ME антитоксических антител).

Примечание: перед введением смесь испытуемого материала и антисывороток вы­держивают при +18°С 30 минут.

Наблюдение - 4 дня. При наличии токсина дыхание учащенное, мышцы расслаб­ленные, причем, брюшная стенка «западает», перед гибелью у мышей появляются судоро­ги, развивается паралич.

В случае гибели всех 4 мышей повторить реакцию нейтрализации с разведенным (в 5, 10, 20, 100 раз) экстрактом (или центрифугатом). После гибели животных повторяют

реакцию нейтрализации с моновалентными сыворотками.

Для определения типа токсина берут 6 рядов пробирок.

Ингредиенты			Проб	и р к и
	1	2	3	4	5	6
1 .Фильтрат 2.Антитоксическая сы-	2,4	2,4	2,4	2,4	2,4	2,4
' воротка типа А	0,6	-	-	-	-	-
- ”- типа В	-	0,6	-	-	-	-
- ” - типа С	-	-	0,6	-	-	-
- ” - типа Е	-	-	-	0,6	-	-
- ” - типа F	-	-	-	-	0,6	-
3.Физиологический раствор						0,6

Выдержать 30 мин. при +18оС, ввести в/б 2 мышам по 1 из на каждой пробирки (для каждой сыворотки - отдельный шприц). Учет реакции через 4,6 часов, 24 и 96 часов.

При наличии токсина выживут мыши, получившие смесь токсина и гомологичной сыворотки. Например, если погибнут все мыши, кроме тех, которым введен экстракт с сы­вороткой типа А, то в материале содержится токсин типа А.

Для определения токсинемии

Ингредиенты	Пробирки
	1	2	3
1. Сыворотка больного	1,8	1,8	1,8
2. Антитоксическая сы­
воротка типа А
3. -”- типа Б	0,4	-	-
4. - ” - типа Е		0,4	-
	-	-	0,4

30 минут при комнатной температуре, содержимое пробирок - по 1.0 мл ввести двум мышам в/б.

Учет по вышеописанным правилам.

Приложение № 6

Обнаружение возбудителя ботулизма

1. Материал

- рвотные массы,

Цель - накопление возбудителя в 4 флаконах:

№ 1	№2	№3	№4
Казеиново-грибная среда	То же	То же	То же
(посев во флаконы емко­	Не подогревать	Прогреть при	Прогреть при
стью 100-200 мл)		60°С 15 мин.	80°С 20 мин.

В термостат, инкубация при +26°-35°С.

II.

Если в материале присутствуют споровые формы Bac.botulinum, то рост появляется только в прогретых пробирках. Если в материале присутствуют вегетативные формы, то рост появляется только в негретых пробирках.

II. Материал - рост на среде накопления.

Цель - получение О изолированной колонии.

Посевы на:

О

О

О

О

печеночный агар кровяной агар

+ 35°С, 48 часов в анаэростате или в эксикаторе.

III.

Материал - изолированная колония. Цель - накопление чистой культуры

По Граму

IV.

Материал - рост чистой культуры на среде Китт-Тароцци.

Цель - идентификация микробного вида.

• Изучение биохимической активности.

• Реакция агглютинации с типовыми сыворотками.

• Ферментативные свойства бацилл ботулизма.

О		О	О

Среда Китт-Тароцци

35°С, 24 часа.

подвижность

С учетом анаэробности

Типы	Углеводолитическая активность			Протеолитическая активность
бацилл	гл	мл	сах	лакт	желатина	H2S
Т и п А	кг	кг	-	-	+	+
Тип В	кг	кг	кг	-	+	+
Тип С	кг	кг	-		+	+
Т и п Д	к	к	к	к	+	+
Тип Е	кг	кг	кг	-	+	+

Ускоренные методы:

1. Метод определения фагоцитарного показателя.

Сущность метода: Ботулинический токсин угнетает фагоцитарную активность лей­коцитов в 3-20 раз. К цитратной крови больного (в 3 пробирки) добавляют иммунные ан­титоксические сыворотки (А, В, Е). Выдерживают в термостате 30 минут и добавляют взвесь золотистого стафилококка. После 20 минут инкубации готовят мазки и определяют фагоцитарное число (количество кокков, поглощенных в среднем одним лейкоцитом).

Если в крови больного имеется токсин ботулизма (не инактивированный иммунной сывороткой), то ФЧ резко снижается.