III. Создание глоссария по теме.

Практическое занятие № 2

Тема: «Физико-химические свойства белков. Лабораторные работы:

«Очистка белковых растворов – диализ», «Реакции обратимого осаждения белков - высаливание», «Реакции необратимого осаждения белков солями тяжелых металлов», «Определение белка в моче методом осаждения»

Перечень контрольных вопросов для самоконтроля знаний:

1. Связи, поддерживающие структуры белка: дисульфидные, ионные, водородные, гидрофобные. Взаимосвязь структуры и функции.

2. Денатурация и ренатурация белков

Ориентировочная основа деятельности студентов для проведения лабораторной работы:

Требования к оформлению протокола лабораторной работы

При оформлении протокола лабораторной работы в рабочую тетрадь вносятся следующие данные:

- название работы

- принцип метода исследования

- порядок выполнения работы (алгоритм исследования)

- результаты проведенного анализа, расчеты

- выводы

- КДЗ (клинико-диагностическое значение исследования)

Работа № 1 Очистка белковых растворов – диализ

Принцип метода. Диализ – это процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран (коллодий, целлофан, пергамент, почечные фильтры капсулы Боумена - Шумлянского). Обладая большим диаметром и молекулярной массой, белковые молекулы не способны проникать через мелкие поры, в то время как низкомолекулярные вещества и ионы легко диффундируют через мембраны в окружающую среду.

Порядок выполнения работы: в целлофановый мешочек (диализатор) наливают на 1/3 объема раствор яичного белка, содержащий Nacl (диализируемая жидкость). Диализатор подвешивают на стеклянных палочках и погружают в стакан с дистиллированной водой (диализат). Через 1 час от начала диализа с небольшими порциями диализата и диализируемой жидкости, отобранными с помощью пипетки, проводят пробы на Nacl (хлориды) и белок.

Проба на хлориды: 10 капель исследуемой жидкости + 1 капля 10% раствора HNO₃ + 1% раствора AgNO₃ → наблюдается образование белого творожистого осадка

Проба на белок (биуретовая реакция)

10 капель исследуемой жидкости + 5 капель 10% раствора NaOH + 1 капля 1% раствора CuSO₄ → при наличии белка в растворе проба дает фиолетовое окрашивание, при отсутствии - голубое

Отметить результаты на белок и хлориды с содержимым диализатора и наружной жидкостью. В выводе указать, почему белки не диффундируют через полупроницаемые мембраны.

Клинико-диагностическое значение. Особый вид диализа (гемодиализ) применяется в клинике для очистки крови с целью удаления из нее низкомолекулярных токсических веществ (аппарат «искусственная почка»)

Работа № 2 Реакции обратимого осаждения белков - высаливание

Принцип метода. Высаливание – обратимая реакция осаждения белков из растворов с помощью больших концентраций нейтральных солей: Nacl, (NH₄)₂SO₄ и др. При высаливании происходит дегидратация макромолекул белка. На процесс высаливания влияет ряд факторов: молекулярная масса, заряд, гидрофильность белка, в связи с чем, для осаждения требуется различная концентрация одних и тех же солей. Глобулины, имеющие большую молекулярную массу, осаждаются в полунасыщенном растворе Nacl, а альбумины – в насыщенном. Высаливание белков является обратимой реакцией, т.к. осадок белка может вновь растворяться после удаления Nacl, например, с помощью диализа.

Порядок выполнения работы:

1). К 40 каплям раствора яичного белка добавляем Nacl (кристаллический) до полунасыщения → выпадает белый аморфный осадок глобулинов.

Через 10 минут (время полного осаждения глобулинов) осадок отфильтровывают.

2). Пробирку с фильтратом, содержащим альбумин, кипятят несколько минут. Наблюдается необратимое осаждение альбуминов, вызванное денатурацией белка и потерей растворимости. Выпавший осадок альбумина отфильтровывают.

3). С конечным фильтратом проделывают биуретовую реакцию (см. Диализ). В отсутствии белка в фильтрате убеждаются по отрицательным результатам биуретовой реакции. Для сравнения проделать биуретовую реакцию с исходным раствором яичного белка. Отметить результаты биуретовой реакции. В выводах указать, какая из белковых фракций легче осаждается и причины этого явления.

Клинико-диагностическое значение. Метод используется для фракционирования белков (разделения белков по фракциям), что позволяет использовать отдельные белковые фракции крови с лечебными целями (альбумин, γ-глобулины, фибриноген плазмы крови и др.)

Работа № 3 Реакции необратимого осаждения белков солями тяжелых металлов

Принцип метода. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (медь, железо, свинец, ртуть и др.) денатурируют и образуют нерастворимые в воде комплексные соединения, которые выпадают в осадок. Возникновение нерастворимых в воде комплексов обусловлено адсорбцией ионов металла на поверхности белковой молекулы. В избытке солей образовавшиеся осадки растворяются, что связано с адсорбцией тяжелого металла на поверхности коллоидных частиц и появлением положительного заряда на молекуле белка (адсорбционная пептизация, исключение – соли AgNO₃ и Hgcl₂).

Порядок выполнения работы:

1. В три пробирки наливают по 10 капель раствора яичного белка

2. В пробирку №1 добавляют 1-2 капли 5% раствора CuSO₄

3. В пробирку №2 добавляют 1-2 капли 5% раствора Pb(CH₃COO)₂

4. В пробирку №3 добавляют 1-2 капли 1% раствора AgNO₃

Выпадает осадок белка во всех трех пробирках.

5) В каждую из трех пробирок добавляют избыток реактива.

В пробирке №1 и №2 может наблюдаться эффект растворения осадка

Клинико-диагностическое значение. Тяжелые металлы в высоких дозах оказывают токсическое действие (неблагоприятный экологический фактор).

На способности белков образовывать нерастворимые осадки с солями тяжелых металлов основывается использование белков в качестве антидотов (противоядий) при пероральном отравлении тяжелыми металлами. Сразу после отравления обычно применяют белки молока или яиц, пока соли находятся в желудке и не успели всосаться. Вслед за дачей белка у больного вызывают рвоту, чтобы удалить токсичные металлы из организма.

Работа № 4 Определение белка в моче методом осаждения

Принцип метода. Белки при взаимодействии с концентрированными минеральными кислотами денатурируют и выпадают в осадок.

Для обнаружения белка в моче применяют реакции необратимого осаждения с помощью азотной и сульфосалициловой кислот (последняя – самая чувствительная).

Порядок выполнения работы: К 1 мл мочи приливают 3 капли 20% сульфосалициловой кислоты. При наличии белка в моче образуется белый осадок (или помутнение), интенсивность которого зависит от концентрации белка в моче. Все реакции на патологические компоненты мочи выполняются студентами одновременно с исследованием нормальной мочи. В выводах указать возможную причину появления белка в моче.

Клинико-диагностическое значение. Белок в нормальной моче находится в виде следов, которые не открываются обычными реакциями, применяемыми в клинической лаборатории. При ряде заболеваний с мочой начинает выделяться заметное количество белка, начиная с долей грамма до 25 г/сутки. Появление белка в моче называется протеинурией или альбуминурией, поскольку моча содержит, в основном, сывороточный альбумин и лишь частично сывороточный глобулин. Белок появляется в моче при нефрите (воспалении сосудистых клубочков почек, что приводит к увеличению их проницаемости); в случае сердечной декомпенсации; при некоторых формах повышенного артериального давления; иногда при беременности; при приеме некоторых лекарственных препаратов и др.