ганизма, причем он может действовать как непосредственно, так и опосредованно (например, стимулируя высвобождение вазопрессина). Показано участие оксида азота, выделяющегося в синоатриальном узле, в автономном контроле сердцебиения.
Снижение содержания цитоплазматического цГМФ при активации клеточных рецепторов L-глутаматом и его производными является NO-зависимым процессом. В зависимости от уровня NO он может или ингибировать, или потенцировать высвобождение глутамата и аспартата, тем самым защищая нейроны от экзайтотоксических эффектов медиатора. Избыточная продукция или недостаточно быстрая нейтрализация глутаминовой и аспарагиновой аминокислот, выполняющих роль возбуждающих медиаторов в нейронах, приводит к нейротоксическим эффектам. В основе токсического действия лежит стимуляция АФК, способная приводить к окислительному повреждению тканей. Кроме того, NO защищает головной мозг от ишемических и нейротоксических инсультов, контролирует осцилляторную активность нейронов.
7.4.НАРУШЕНИЯ МЕМБРАННЫХ СТРУКТУР, СВЯЗАННЫЕ
СПОВЫШЕНИЕМ КОНЦЕНТРАЦИИ АФК
Все формы АФК при повышении их стационарного уровня проявляют высокую цитотоксичность в отношении любых типов клеток. Можно выделить четыре наиболее вероятных мишени окислительной цитотоксической атаки АФК: повреждение мембраносвязанных белков, индукция процессов ПОЛ в биологических мембранах, инактивация цитозольных ферментов и повреждение митохондриальной и ядерной ДНК (первая является более уязвимой, поскольку лишена гистонов, проявляющих стабилизирующее действие). Действие АФК на любой из перечисленных видов макромолекул может стать критическим для жизнедеятельности клетки.
Окислению АФК в первую очередь подвергаются SH-содержа- щие группы белков. Основную опасность АФК представляют для транспортных АТФаз, содержащих SH-группы - Са2+-АТФазы (ее повреждение приводит к нарушению транспорта ионов кальция
161
через мембрану) и Na/K-АТФазы (ее подавление губительно сказывается на гомеостазе одновалентных катионов клетки).
Массированное окисление мембранных липидов приводит к необратимому повреждению мембранных структур, нарушению их проницаемости для ионов. Наиболее подвержены перекисному окислению входящие в состав мембран ненасыщеные жирные кислоты: линолевая, арахидоновая, докозагексаеновая. Окисление липидов приводит к образованию их гидроперекисей и вызывает приток молекул воды в поврежденные зоны бислоя. В числе продуктов ПОЛ – токсичные и мутагенные альдегиды (рис. 59). Так, главный продукт окисления арахидоновой кислоты, 4-гидроксиноненаль может сшивать белковые молекулы, на-
Рис. 59. Схематическое изображение свободнорадикального окисления линолевой кислоты и образующихся при окислении продуктов
162
рушая их структуру и функционирование. Он обладает цитотоксическим и мутагенным действием.
При изучении свободнорадикального окисления особое внимание уделяется липопротеинам низкой плотности (ЛНП, см. ниже), ибо эти частицы в отличие от липопротеинов высокой плотности, при окислительной модификации могут становиться цитотоксичными. Повышение уровня АФК в плазме крови вызывает окислительную модификацию ЛНП, и создавать потенциальную угрозу организму. На страже этого процесса стоят макрофаги, улавливающие такие опасные ЛНП своими рецепторами и нейтрализующие их.
Одним из заболеваний, начинающихся при недостаточной защитной деятельности макрофагов, является атеросклероз – хроническое заболевание артерий, сопровождающееся образованием утолщений стенки артерий (бляшек), суживающих просвет сосудов и способствующих тромбообразованию. Это – широко распространенное заболевание: около половины всех людей, живущих в цивилизованных странах, умирают от осложнений атеросклеротического процесса в сосудах различных органов (инфарктов, инсультов и др.).
Начинается атеросклероз в результате структурных изменений в интиме (внутреннем слое) и в медии (мышечном слое) сосудистой выстилки артерий, которые на первом этапе характеризуются накоплением холестерина в составе внеклеточных липидных частиц и массивных отложений эстерифицированного холестерина в составе пенистых клеток, имеющих в цитоплазме массивные липидные включения, в большинстве представленные эфирами холестерина. Появление в интиме пенистых клеток является маркером начала атеросклеротического процесса. На последующих стадиях наблюдается разрастание соединительной ткани и увеличением хо- лестерино–фиброзных и кальциевых отложений. Основная масса эфиров холестерина в этих отложениях происходит из циркулирующих в крови ЛНП. Показано, что пенистые клетки являются в основном макрофагами моноцитарного происхождения и частично – пролиферирующими гладкомышечными клетками.
163
Стимулом к изучению роли окисленных ЛНП в атерогенезе послужило открытие в макрофагах специальных скэвенджер-рецеп- торов (рецепторов-«мусорщиков») распознающих окисленные ЛНП. Первоначально они были описаны как рецепторы к ацетилированным ЛНП, однако дальнейшие исследования показали их высокое сродство к ацетоацетилированным, карбамилированным, сукцинилированным, и окисленным ЛНП, а также к определенным полирибонуклеотидам (политимин), полисахарам (декстрансульфат, каррагенан), некоторым фосфолипидам и бактериальным липополисахаридам. Общим признаком всех лигандов для скэвенд- жер-рецепторов является наличие полианионных комплексов. В отличие от рецепторов для нативных ЛНП, скэвенджер-рецепторы связывают только модифицированные ЛНП, и их экспрессия не регулируется внутриклеточным содержанием холестерина. Больше всего скэвенджер-рецепторов выявляется в моноцитах/макрофагах и в клетках печени, где они представлены даже в большем количестве. Надо указать, что наличие этих рецепторов в печени имеет функциональное значение в защите от атеросклероза, позволяя печени нейтрализовать избыток пенистых клеток.
Захват макрофагами окисленных ЛНП, имеющих высокое сродство к скэвенджер-рецепторам, приводит к накоплению в них эфиров холестерина и формированию пенистых клеток, во многом идентичных клеткам атеросклеротической бляшки. Тот факт, что формирование пенистых клеток происходит при инкубации макрофагов только с окисленными или модифицированными («атерогенными»), но не с нативными ЛНП, послужил основой концепции, согласно которой начальным этапом атерогенеза является возникновение окисленных ЛНП, цитотоксичных для эндотелиоцитов и усиливающих адгезию нейтрофилов, что вызывает повреждение эндотелия; захват окисленных ЛНП макрофагами и приводит к образованию пенистых клеток, их накоплению в интиме сосудов и в последующем – к формированию атеросклеротической бляшки.
После приема пищи в кишечнике образуются хиломикроны, которые из кровотока быстро поглощаются печенью. В печени синтезируются богатые триглицеридами липопротеины очень низкой
164
плотности, основной функцией которых является снабжение периферических тканей жирными кислотами. В результате действия липопротеинлипаз, находящихся на поверхности эндотелиоцитов, происходит гидролиз триглицеридов липопротеинов очень низкой плотности, которые превращаются вначале в липопротеины промежуточной плотности, а затем в богатые холестерином ЛНП. В процессе деградации липопротеинов очень низкой плотности образуются также липопротеины высокой плотности, одновременно этот класс липопротеинов может синтезироваться в печени. Формирование ЛНП сопровождается переносом эфиров холестерина с липопротеинов высокой плотности с помощью специального переносящего эфиры холестерина белка. Если липопротеины очень низкой плотности удаляются из циркуляции через несколько часов, то время полувыведения ЛНП – 2 дня. Средняя концентрация ЛНП в сыворотке нормолипидемических пациентов составляет около 3 мг/мл, при этом в данных частицах содержится около 60% всего сывороточного холестерина. Удаление ЛНП из циркуляции происходит посредством эндоцитоза через рецепторы к апопротеинам В и Е (В/Е рецепторы), а также рецептор-независимым путем. Нарушение рецепторного связывания ЛНП в результате повреждения гена, кодирующего В/Е-рецептор, приводит к аномально высокому уровню ЛНП и холестерина в крови (семейная гиперхолестеринемия).
На каждую частицу ЛНП (рис. 60) приходится около 1600 молекул эфиров холестерина и 200 молекул триглицеридов, которые организуют центральное липофильное ядро; это ядро окружено монослоем из 700 молекул фосфолипидов и 600 молекул свободного холестерина; в монослой встроен апопротеин В (апо-В) – белок с молекулярной массой около 500 кДа, служащий для рецепторного связывания ЛНП с клетками. Имеются данные, что на поверхности частиц ЛНП апо-В располагается тонким слоем (толщиной около 10 Å) и покрывает площадь около 480 нм2. Основным субстратом свободнорадикального окисления в ЛНП служат ненасыщеные жирные кислоты, среди которых главной (около 90% общего состава) является линолевая.
165
Выделенные из атеросклеротических бляшек ЛНП по сравнению с нативными имеют повышенное содержание перекисей липидов, сниженное содержание ненасыщенных жирных кислот, фрагментированный апо-В, несут отрицательный заряд и обладают высоким сродством к скэвенджер-рецепторам макрофагов. Аналогичные изменения в ЛНП наблюдаются при их длительном (несколько месяцев) хранении, при инкубации с ионами железа или меди (создающим условия для их окисления). Вместе с тем, различий в содержании жирорастворимых антиоксидантов (α-токоферол, β-каротин) в липопротеинах атеросклеротических бляшек и сыворотки крови не выявлено, хотя окисление in vitro приводит к снижению содержания этих соединений в ЛНП.
Рис. 60. Схема строения липопротеина плазмы крови
166
Увеличение отрицательного заряда в окисленных ЛНП является результатом накопления продуктов ПОЛ и окисления положительно заряженных лизиновых остатков апо-В. Свободнорадикальное окисление ЛНП, индуцированное ионами металлов переменной валентности (Сu2+ или Fe2+), приводит к изменению их химического состава, что характеризуется снижением содержания свободных жирных кислот, полным исчезновением антиоксидантов и значительным повышением содержания продуктов окисления (гидроперекисей, оксистеролов, диенов), которых в свежевыделенных ЛНП мало (рис. 61). Окисление ЛНП приводит также к изменению их физических и биологических свойств.
Перекисное окисление липидов может приводить к повреждению или модификации всех основных функций биологических мембран: барьерной, рецепторной, каталитической. Известно по крайней мере 3 первичных механизма повреждения биомембран в результате инициации перекисного окисления липидов.
В результате появления гидрофильной гидроперекисной группировки в полиненасыщенной жирной кислоте, входящей в состав мембранного фосфолипида, нарушается гидрофобность фосфолипидного бислоя, при этом резко увеличивается его пассивная проницаемость для ионов.
Рис. 61. Механизмы цитотоксического действия окисленных ЛНП (Зенков и др., 2001)
167
Образующиеся в ходе липопереокисления диальдегиды типа МДА обладают свойствами поперечносшивающих бифункциональных реагентов. Они способны приводить к полимеризации и агрегации биомолекул (белков и липидов в мембранах), накоплению липофусциновых бляшек.
Перекисные радикалы осуществляют окисление аминокислотных остатков (в первую очередь SH-содержащих: гистидина, триптофана и др.) мембранных белков, в том числе остатков, локализованных в активном центре ферментов, что приводит к утрате ферментативной активности.
Эти три первичных модифицирующих эффекта АФК и липидных радикалов, образующихся в результате ПОЛ, обусловливают многообразные проявления перекисного окисления как на уровне молекулярной организации биомембран, так и в отношении их функциональных характеристик. Наиболее типичными из них являются: ограничение молекулярной подвижности фосфолипидов; появление «перекисных кластеров» в липидном бислое, уменьшение количества жидких липидов в микроокружении мембранных белков и нарушение липид-белковых взаимодействий, устранение характерной для нативных мембран трансбислойной асимметрии липидов, уменьшение толщины гидрофобной зоны мембран и усиление трансмембранной миграции интегральных белков, появление каналов проницаемости для ионов, снижение каталитической активности и термостабильности мембранных белков, снижение электрической прочности мембран (уменьшение потенциала пробоя), их дезинтеграция и фрагментация. Наиболее наглядно все изменения проявляются на примере саркоплазматического ретикулума миоцитов.
При индукции перекисного окисления липидов в саркоплазматическомретикулумемышечныхклетокнарушаетсятранспортнаяфункция кальциевого насоса. Коэффициент Са2+/АТФ, в нормальных условиях составляющий величину, равную 2, снижается по мере накопления в мембранах продуктов липопереокисления. В основе этого эффекта лежит увеличение проницаемости для ионов мембран саркоплазматического ретикулума. Каталитическая активность Са-АТФазы более устойчива к индукции липопереокисления, но на более поздних стадиях
168
ПОЛ проявляется и ее ингибирование. По-видимому, этот процесс обусловлен накоплением межмолекулярных белковых сшивок. Кроме этого наблюдаются и прямое окисление молекул Са-АТФа- зы поскольку она содержит легко окисляемые SH-группы в составе активного центра. При окислении Са-АТФазы она превращается в нерегулируемый канал для кальция, через который эти ионы начинают выходить из полостей ретикулума в цитоплазму, нарушая кальциевый гомеостаз и тем самым работу Са-контролируемых систем клетки (рис. 62).
Активность многих мембранных ферментов существенно зависит от микровязкости мембран и химической природы окружающих белки липидов. Так, например, меняя фосфолипидный состав везикул, в которые встроена Са-АТФаза, можно заметно влиять на активность фермента, причем, чем меньше микровязкость липидного бислоя, тем выше скорость работы насоса. При изменении температуры в эксперименте микровязкость липидного бислоя и активность Са-АТФазы изменяются синхронно. Увеличение микровязкости липидного слоя вы-
званное окислением фосфолипидов, также приводит к снижению активности фермента.
Эти данные говорят, что хотя присоединение субстрата и его превращения на теле АТФазы происходят, в основном, в гидрофильном окружении, реакции, сопряженные с переносом ионов, затрагивают белковые домены, погруженные внутрь бислоя. Они то и определяют чувствительность транспортного
169
белка к состоянию липидного окружения. По-видимому, к упаковке липидного окружения чувствительны те мембранные ферменты, при работе которых происходит изменение их конформации и, соответственно, конформационно-активные процессы и будут зависеть от микровязкости мембранных липидов, Действительно, было показано, что скорость распада фер- мент-фосфатного комплекса Са-АТФазы уменьшается с ростом микровязкости. Это подтверждает, что на этой стадии происходит конформационный сдвиг, связанный с переносом ионов через мембрану. Повышение микровязкости клеточных мембран вследствие избытка холестерина или перекисного окисления мембранных липидов может привести к ухудшению работы ферментных систем, осуществляющих выкачивание Са2+ из клетки, и в результате к нарушению кальциевого гомеостаза клетки.
170