Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Литература / Биологическая Химия Северин 2008

.pdf
Скачиваний:
28344
Добавлен:
17.06.2017
Размер:
6.06 Mб
Скачать

Раздел 3. Синтез нуклеиновых кислот и белков

91

Легкие (L) цепи кодируются тремя сегментами: V-вариабельным, J-соединяющим и С-константным, а каждая тяжелая (Н) цепь — четырьмя сегментами: V, D — сегментом разнообразия, J и С. Количество V сегментов составляет несколько сотен, D-сегментов у человека 15, J-сегментов — 4–5, а С-сегментов от одного для семейства κ до 10 для С-сегментов тяжелых цепей.

Взародышевых кроветворных и всех соматических клетках, не синтезирующих антител, сегменты, кодирующие V- и С- домены L- и Н- цепей, разделены протяженными нуклеотидными последовательностями. В ходе дифференцировки клеток-предшественников в зрелые В-лимфоциты полные гены L-цепей собираются из трех сегментов в результате одной соматической рекомбинации: один из 300 V-сегментов перемещается в область, находящуюся непосредственно перед одним из пяти J-сегментов, с образованием смешанного VJ-экзона. При формировании полного гена Н-цепи первоначально собирается смешанный экзон из двух любых D- и J- сегментов в процессе первой рекомбинации. Затем в участок непосредственно перед DJ-экзоном перемещается один из Vн сегментов

входе второй рекомбинации и образуется полный ген Н-цепи Ig M (рис. 3.27), поскольку к смешанному VнDнJн-экзону, кодирующему вариабельный домен Н-цепи ближе всех находится Сµ-сегмент. Десять Сн-сегментов константной области содержат информацию о строении доменов этой области и определяют классы и подклассы иммуноглобулинов: Ig M, Ig G, Ig A и т.д.

Переключение синтеза антител с одного класса на другой сопровождается дополнительной рекомбинацией, в процессе которой удаляются Сн сегменты между полным геном вариабельного домена VнDнJн и Сн областью синтезируемого класса.

Взрелых В-лимфоцитах помимо рекомбинаций происходят соматические мутации в вариабельных участках Н- и L-генов иммуноглобулинов, что делает многообразие антител практически неисчерпаемым.

3.10. Использование ДНК-технологий в медицине

В настоящее время интенсивно развиваются методы, позволяющие выделять гены или их фрагменты из гигантских молекул ДНК, получать большое количество копий этого материала и использовать его для выявления:

мутаций в генах;

инфицированности человека бактериальными или вирусными заболеваниями;

носительства патологических генов, являющихся причиной наследственных болезней, а также для идентификации личности и установления родства.

92

Биологическая химия

 

 

 

 

 

 

Рис. 3.27. Образование мРНК, кодирующей строение одной из Н-цепей иммуноглобулинов.

Ген, кодирующий одну из возможных тяжелых цепей Ig, образуется в результате двух последовательных рекомбинаций, которые объединяют сегменты вариабельного домена и приближают их к константному сегменту. Удаление лишних J сегментов и интронов происходит в ходе посттранскрипционной модификации пре-мРНК sp — экзон, кодирующий сигнальный пептид

С этой целью из тканей и клеток, содержащих ядра лейкоцитов, слюны, мочи, биоптатов, гистологических срезов, выделяют ДНК и фрагментируют с помощью гидролитических ферментов — рестриктаз. Рестриктазы узнают определенные короткие последовательности нуклеотидов (4–6 нуклеотидных пар) и расщепляют обе нити ДНК с образованием двуцепочечных («слепых») или одноцепочечных («липких») концов. Количества каждого фрагмента очень мало, поэтому нужный для исследования фрагмент многократно удваивают (амплифицируют) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или в составе рекомбинантной ДНК.

Рекомбинантные ДНК — ДНК, построенные из участков разного происхождения. Их получают следующим образом: ДНК из двух разных источников, чаще всего ДНК человека и ДНК плазмиды (небольших кольцевых молекул ДНК, способных автономно реплицироваться в бактериальных клетках), или вируса,

Раздел 3. Синтез нуклеиновых кислот и белков

93

 

 

 

 

Рис. 3.28. Схема клонирования ДНК в бактериальных клетках:

1 — ДНК человека и вируса, являющегося вектором, расщепляют с помощью одной и той же рестриктазы, образующей фрагменты с «липкими» концами; 2 — фрагменты объединяются за счет комплементарного взаимодействия азотистых оснований и сшиваются ДНК-лигазой;

3 — получают вирусы, в состав которых входят рекомбинантные ДНК, образованные ДНК вируса и генами человека, ими трансформируют бактериальные клетки; 4 — в процессе роста трансформированных клеток получают значительные количества генетического материала человека

94

Биологическая химия

фрагментируют одной и той же рестриктазой с образованием «липких» концов (рис. 3.28). После денатурации молекул нагреванием и последующего медленного охлаждения («отжига») ДНК ренативирует, и наряду с исходными молекулами за счет «липких» концов получаются рекомбинантные молекулы, состоящие из участков ДНК человека и плазмиды (вируса). Эти участки сшивают ДНКлигазой, и гибридную плазмиду (вирус) вводят в бактериальные клетки. При выращивании трансформированных бактерий в культуре экспрессируются «чужие» гены, и из бактериальной массы можно получить значительные количества интересующей нас ДНК, мРНК и белка.

Для получения рекомбинантных ДНК кроме фрагментов ДНК, выделенных из клеток тканей, используют ДНК, синтезированную с помощью обратной транскриптазы или РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Фермент по принципу комплементарности катализирует синтез ДНК из четырех дНТФ на матрице мРНК. Продукт реакции — ДНК, не содержащая интронов, в отличие от участков ДНК из ядерного материала клеток эукариотов.

Фрагменты ДНК длиной в несколько сотен нуклеотидных пар можно амплифицировать с помощью ПЦР в условиях in vitro (в пробирке). Для проведения ПЦР нужно знать нуклеотидную последовательность концевых участков фрагмента. В соответствии с этим химическим путем синтезируют два праймера — одноцепочечных олигодезоксинуклеотида, состоящих из 15–30 нуклеотидов, и комплементарных 3’-концам обеих нитей копируемой ДНК-матрицы.

Реакционная смесь для получения копий содержит:

матрицу — ДНК, выделенную из исследуемого образца;

субстраты — 4-е дНТФ;

фермент — термостабильную ДНК-полимеразу (Taqполимеразу);

два праймера;

буфер для создания оптимального рН и ионы Мg2 + , являющиеся кофактором Taq-полимеразы;

Праймеры ограничивают участок ДНК, который должен быть амплифици-

рован. Каждый цикл получения копий ДНК включает три стадии:

• плавление: реакционную смесь нагревают до 90–95°, ДНК денатурирует,

образуя одноцепочечные нити;

• гибридизацию ДНК с праймерами: температуру снижают до 50–60° и

праймеры комплементарно связываются с нитями ДНК;

• элонгациа: присоединение Taqполимеразы к 3'-концам праймеров и синтез ДНК в направлении от 5'- к 3'-концу комплементарно ДНК-мат- рице.

Процесс автоматизирован, проводится в приборе — циклизаторе или амиплификаторе ДНК, который позволяет задавать нужное количество циклов и оптимальные временные и температурные параметры. За 25–30 циклов синтезируется несколько миллионов копий (рис. 3.29).

Раздел 3. Синтез нуклеиновых кислот и белков

95

 

 

 

 

Рис. 3.29. Полимеразная цепная реакция.

Праймеры — полученные химическим синтезом олигодезоксирибонуклеотиды. Стадия 1 и 2 — нагревание до 90–950 и денатурация ДНК, охлаждение до 50–600 и комплементарное связывание ДНК с праймерами

Стадия 3 — элонгация праймеров с участием Taq-полимеразы и дАТФ, дГТФ, дТТФ и дЦТФ при температуре ~700

96

Биологическая химия

Используя указанные технологии и ДНК-конструкции, решаются не только ранее перечисленные задачи, но также:

выращиваются модифицированные микроорганизмы как продуценты гормонов (инсулина, гормона роста, соматостатина и др.), биологически активных пептидов, факторов, участвующих в свертывании крови;

создаются новые виды растений и животных

пытаются лечить наследственные болезни путем введения в клетки генов, которые у пациентов утрачены или дефектны. Для этих целей все чаще используют полимерные носители — наночастицы, осуществляющие направленную доставку необходимых компонентов в поврежденные органы и ткани.

Раздел 4

Биологические мембраны

Все живые клетки отделены от окружающей среды поверхностью, называемой клеточной мембраной. Кроме того, для эукариотов характерно образование внутри клеток компартментов. Они представлены рядом субклеточных органелл, ограниченных мембранами, например ядро и митохондрии. Мембраны представляют собой не только статически организованные поверхности раздела, но и включают активные биохимические системы, отвечающие за такие процессы, как избирательный транспорт веществ внутрь и наружу клетки, связывание гормонов и других регуляторных молекул, протекание ферментативных реакций, передача импульсов нервной системы и т.д. (рис. 4.1). Существуют различные типы мембран, отличающиеся по выполняемым функциям. Функции мембран обусловлены их строением.

Рис. 4.1. Функции мембран

97

98

Биологическая химия

Химический состав

Мембраны состоят из липидных и белковых молекул, относительное количество которых варьирует (от 1/5 — белок + 4/5 — липиды до 3/4 — белок + 1/4 – липиды) у разных мембран. Углеводы содержатся в форме гликопротеинов, гликолипидов и составляют 0,5–10% вещества мембраны.

Липиды мембран

Основная часть липидов в мембранах представлена фосфолипидами, гликолипидами и холестеролом. Строение этих липидов представлено на рис. 4.2. Ли-

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CH3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

+

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

H3C

 

 

N

 

 

CH3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CH2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

+ CH3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CH2

 

 

 

 

O CH2

CH2

N

CH3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

O

 

 

 

 

 

 

 

 

O

P

O-

 

 

 

CH3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

O

 

 

 

 

 

 

O-

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

P

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

O

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

O

 

 

 

 

 

 

 

CH2

CH

CH2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Гидрофобный

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

"хвост"

 

O

O

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CH2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

H

 

C

 

 

 

 

NH

 

 

C O C

O

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

O

 

 

 

 

 

 

 

 

H

 

C

 

 

 

OH C

 

 

 

CH2

CH2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CH

 

 

CH2

 

 

R1

R2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

R1

 

R2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Длинные

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Длинные

 

алифатические

 

 

 

 

 

 

 

 

 

алифатические

 

 

цепи

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

цепи

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

21

22

 

24

 

26

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

18

20

 

23

 

 

 

 

 

25

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

12

17

 

 

 

 

 

 

 

27

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

19

11C 1413

D 1516

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

1

10

9

8

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A

B

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3

4

5

6

7

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

HO

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 4.2. Строение некоторых липидов, входящих в мембраны

Раздел 4. Биологические мембраны

99

пиды мембран имеют в структуре две части: неполярный гидрофобный «хвост» и полярную гидрофильную «голову». Такую двойственную природу соединений называют амфифильной. Липиды мембран образуют двухслойную структуру. Каждый слой состоит из сложных молекул липидов, расположенных таким образом, что неполярные гидрофобные «хвосты» находятся в тесном контакте друг с другом. Так же контактируют гидрофильные части молекул. Все взаимодействия имеют нековалентный характер. Два монослоя ориентируются «хвост к хвосту», так, что образующаяся структура двойного слоя имеет внутреннюю неполярную часть и две полярные поверхности. Белки мембран включены в липидный бислой тремя способами:

1)связаны с гидрофильной поверхностью липидного бислоя — поверхностные мембранные белки;

2)погружены в гидрофобную область бислоя;

3)пронизывают мембрану — интегральные мембранные белки. Поверхностные белки своими гидрофильными радикалами аминокислот вза-

имодействуют нековалентными связями с гидрофильными группами липидного бислоя. Интегральные белки различаются по степени погруженности в гидрофобную часть бислоя. Они могут располагаться внутри мембраны и частично погружаться в мембрану либо прошивать мембрану насквозь. Внутримембранная часть интегральных белков содержит большое количество аминокислот с гидрофобными радикалами, которые обеспечивают гидрофобное взаимодействие с липидами мембран. Гидрофобные взаимодействия поддерживают определенную ориентацию белков в мембране. Гидрофильная выступающая часть белка не может переместиться в гидрофобный слой. Часть мембранных белков ковалентно связаны с моносахаридными остатками или олигосахаридными цепями и представляют собой гликопротеины. Примеры расположения белков и липидов в мембране представлены на рис. 4.3.

Асимметрия мембран

Хотя каждый монослой образован из липидов, ориентированных одинаковым образом, тем не менее липидный состав монослоев различен. Например, в плазматической мембране эритроцитов фосфатидилхолины преобладают в наружном слое, а фосфатидилсерины — во внутреннем слое мембраны. Углеводные части белков и липидов располагаются на наружной части мембраны. Кроме того, поверхности мембраны отличаются по составу белков. Степень такой асимметрии мембран различна у разных типов мембран и может меняться в процессе жизнедеятельности клетки и ее старения.

Жесткость и текучесть мембран также зависят от ее состава. Повышенная жесткость обуславливается увеличением соотношения насыщенных к ненасыщенным жирным кислотам в составе фосфолипидов, а также холестерола. Физические свойства мембран зависят от расположения белков в липидном

100

Биологическая химия

 

 

 

 

 

 

Рис. 4.3. Структура плазматической мембраны

слое. Липиды мембран способны к диффузии в пределах слоя параллельно поверхности мембраны (латеральная диффузия). Поверхностные белки тоже способны к латеральной диффузии. Поперечная диффузия в мембранах сильно ограничена.

Мембранный транспорт

Транспорт веществ внутрь и наружу клетки, а также между цитоплазмой и различными субклеточными органеллами (митохондриями, ядром и т.д.) обеспечивается мембранами. Если бы мембраны были глухим барьером, то внутриклеточное пространство оказалось бы недоступным для питательных веществ, а продукты жизнедеятельности не могли бы быть удалены из клетки. В то же время при полной

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Оставленные комментарии видны всем.

Соседние файлы в папке Литература