- •Свойства высокомолекулярных соединений и их растворов. Практическая значимость темы
- •Классификация полимеров
- •Биополимеры
- •Особые свойства вмс
- •Свойства растворов вмс.
- •Природа растворов вмс.
- •Свойства растворов вмс общие с истинными растворами нмс
- •Свойства растворов вмс общие с коллоидными растворами
- •Особые свойства растворов вмс
- •Вязкость растворов вмс
- •Осмотическое давление растворов вмс.
- •Защитное действие вмс в коллоидных растворах.
- •Коацервация
- •Свойства растворов полиэлектролитов.
- •Изоэлектрическое состояние
- •Свойства растворов белков в изоэлектрическом состоянии.
- •Электрофорез.
- •Факторы, влияющие на электрофоретическую подвижность
- •Методы электрофореза
- •Зональный электрофорез
- •Применение электрофореза
Методы электрофореза
Существует множество разновидностей и модификаций метода электрофореза, которые используются в различных областях.
Выделяют три основных типа электрофоретических систем: электрофорез с подвижной границей, зональный электрофорез и стационарный (вытесняющий) электрофорез.
Электрофорез белков подразделяется также на одномерный и двумерный, препаративный и аналитический, а также электрофорез нативных белков. В случае использования иммунологических методов для выявления разделенных белков используется иммуноэлектрофорез.
Зональный электрофорез
В случае зонального электрофореза смешивание разделенных зон может быть предотвращено. При этом методе разделение производят в закрепленной среде. Наиболее распространены методы разделения на пористых носителях.
Электрофорез на бумаге. Электрофорез проводят с использованием боратных, фосфатных или веронал-мединаловых буферных растворов. Носителем служит специальная хроматографическая бумага, которую разрезают на полоски требуемого размера. Наносят сыворотку крови на катодный конец смоченной буферным раствором полоски. В зависимости от типа прибора и условий опыта электрофорез на бумаге длится от 4 до 16 часов. Скорость движения белков пропорциональна величине их электрического заряда. За определенное время белковые фракции пройдут различный путь и разделятся.
Схема прибора для электрофореза на бумаге.
Затем белки фиксируют высушиванием и красят красителями. Окрашенные зоны белковых фракций вырезают и элюируют специальным растворителем (растворNaOH) для фотометрического определения каждой фракции. При электрофорезе на бумаге белков сыворотки крови получается до 5 фракций: альбумины, 1-, 2-, -, -глобулины.
Электрофореграмма сыворотки крови на хроматографической бумаге:
1 – альбумин, 2 – 1-глобулин, 3 – 2-глобулин, 4 – -глобулин, 5 – -глобулин.
Электрофорез на ацетатцеллюлозной мембране. Мембрана ацетатцеллюлозы как носитель для электрофореза имеет ряд преимуществ по сравнению с бумагой: однородность, строго определенный размер пор, пониженная адсорбционная способность, что исключает образование размытых полос позади зон. Для окрашивания зон применяют методы аналогичные методам окрашивания зон на бумаге.
Электрофорез в гелях. В этом методе в качестве опорной среды используют крахмальный, агар-агаровый, полиакриламидный гели. Характерной особенностью этой разновидности зонального электрофореза является его высокая разрешающая способность, поскольку гели функционируют как молекулярные сита: крупные молекулы проходят сквозь него тем медленнее, чем меньше размер пор в геле. Методом электрофореза в агаровом геле в сыворотке крови выявляется до 7-8 фракций, а при электрофорезе в крахмальном или полиакриламидном геле – до 20 фракций. Агаровый гель ввиду большого количества воды в нем и вследствие этого большой скорости движения ионов используется в иммуноэлектрофорезе для обнаружения антигенов. Самым перспективным является полиакриламидный гель, так как он прозрачен, обладает значительной механической прочностью, однороден по составу, химически инертен, размер пор у этого геля можно варьировать в широких пределах и его можно использовать с самыми различными буферными растворами. Скорость движения белков пропорциональна их заряду и молекулярной массе.
Фотография электрофореграмм смеси белков, разделенных в полиакриламидном геле, иллюстрирующая разделение белков по заряду и молекулярной массе.
Вариантов проведения электрофореза в полиакриламидном геле много (вертикальный в трубках и горизонтальный на пластинах).
Схема простейшего прибора для электрофореза в геле а - до фракционирования, б - после его окончания |
Схема прибора для электрофореза в горизонтальных пластинах 1-антиконденсационная крышка; 2 – электродный резервуар; 3 - колодец для внесения препарата; 4 - гель; 5 - фитиль; 6-охлаждающий столик |
Вытеснительный электрофорез.
Этот метод характеризуется тем, что через некоторое время после разделения зон устанавливается состояние равновесия, при котором ширина зон в дальнейшем не изменяется. К электрофорезу такого типа относятся изоэлектрическое фокусирование.
Изоэлектрическое фокусирование. Это метод разделения белков, основанный на перемещении их молекул под действием постоянного электрического тока в область с величиной рН, соответствующей изоэлектрической точке данного белка. Между анодом и катодом создается градиент рН с помощью амфолитов. Каждый белок мигрирует к соответствующему электроду и прекращает движение, попадая в зону с pH = pJ (фокусируется). Таким образом, молекулы, имеющие одинаковую изоэлектрическую точку, сконцентрируются в узкой зоне.