5.Простые и сложные способы окраски микроорганизмов. Окраска по грамму

Простой способ окраски мазков производится водным фуксином Пфейффера и метиленовым синим Леффлера. Готовят водный фуксин из фенолового фуксина Циля, разводя его дистиллированной водой в соотношении 1:10. Состав раствора фуксина Циля: основной фуксин – 1 г; спирт этиловый 96 % – 10 мл; фенол кристаллический – 5 г;

глицерин – несколько капель; вода дистиллированная – 100 мл. * Техника приготовления. Фуксин с кристаллами фенола и нескольки­ми каплями глицерина растирают в ступке до гомогенной массы, добавляя малыми порциями спирт. Затем, не прекращая помешивания, постепенно доливают дистиллированную воду. Через 48 ч выдерживания при комнат­ной температуре раствор фильтруют, и он готов к употреблению.

Метиленовый синий Леффлера готовят, прибавляя к 30 мл насыщен­ного раствора метиленового синего (10 г метиленового синего в 100 мл 96 % этилового спирта) 1 мл 1 % натрия гидроксида или калия гидроксида и 100 мл дистиллированной воды.

После окрашивания красители сливают, препарат промывают водой и высушивают между листками фильтровальной бумаги. На сухой мазок наносят каплю масла и микроскопируют с использованием иммерсионного объектива оптического микроскопа. Способность микробов воспринимать красители называется тинкториальными свойствами.

При сложных методах окраски мазков применяют два–три различных по цвету красителя, что позволяет дифференцировать микробы и выявить некоторые нюансы в деталях их строения. К таким методам относят окраску по Граму, Цилю–Нельсену, Нейссеру, Бурри–Гинсу, Романов­скому–Гимзе и некоторые другие.

6. Спирохеты. Их морфология,классификация,роль в патологии человека.

Патогенные спирохеты – спирально извитые, очень тонкие, обла­дающие активной подвижностью бактерии. Состоят из цитоплазматического цилиндра, в составе которого содержится нуклеоид, рибосомы, мезосомы. В отличие от других бактерий в их цитоплазме имеются одна или несколько перекрывающих друг друга периплазматических (осевых) фибрилл, они крепятся ближе к одному из концов и обвивают цитоплазматический цилиндр, т.к. они оч тонкие, то не видны в световой микроскоп. Тело спирохеты покрыто тонкой эластичной внешней оболоч­кой, тесно прилегающей к цитоплазматической мембране.

Спирохеты различают по количеству и форме завитков, х-ру движения, длине и толщине нити, а также по тинкториальным свойствам. Благодаря сократительной способности фибрилл, состоящих из флагеллина, спи­рохеты обладают поступательным, сгибательным и вращательным дви­жением. Эндоспор и капсул спирохеты не образуют, в мазке располага­ются беспорядочно. Грамотрицательны. Окра­шивают их по Романовскому–Гимзе азур–эозином, который позволяет отдифференцировать возбудителей спирохетозов. Подвижность спирохет изучают с помощью фазово–контрастной и темнопольной микроскопии в раздав­ленной капле.

Таксономия, и морфология возбудителей спирохетозов.

По кол-ву и форме завитков, х-ру движ-я и форме концов делятся на 3 рода:

1. Treponema – им заостр концы, 8-12 завитков, оч подвижны (покачивание или вращение в микроскопе). Явл-ся обязат обитателями полости рта, кишечника (в составе норм мкФ). Но Treponema pallidum (бледная спирохета) вызывает сифилис, имеет штопорообразную форму с 8–12 туго зак­рученными и одинаковыми по амплитуде завитками. По Романов­скому–Гимзе окрашивается в бледно–розовый цвет.

2. Borrelia – имеет 1 заострённый и 1 тупой конец, два–три неравно­мерно волнистых завитка. Окрашиваются по методу Романовского – Гим­зе в сине–фиолетовый цвет. Вызывают клещевой бореллиоз у чка, Borrelia recurrentis – эпидемический, а другие виды боррелий – эндемический возвратные тифы, или рекурренсы.

3. Leptospira – имеют S– или С–образную форму, нередко с крючками на концах, около двух десятков мелких завитков. В поперечнике меньше разрешающей силы оптического микроскопа (0,2 мкм), поэтому лучше их изучать в темнопольном микроскопе. По Романовскому – Гимзе окрашиваются в розовый цвет. Вызывают лептоспироз, поражают печень. Заражение от с/х животных и грызунов, испражнения к/х попадают в воду.

7. Химический состав Грам «+» и Грам «–» бактерий. Механизмы окраски по Граму.

Обязательными органоидами являются: ядерный аппарат, цитоплазма, цитоплазматическая мембрана.

Необязательными(второстепенными)структурными элементами являются: клеточная стенка, капсула, споры, пили, жгутики.

1.В центре бактериальной клетки находится нуклеоид- ядерное образование, представленное чаще всего одной хромосомой кольцевидной формы. Состоит из двухцепочечной нити ДНК. Нуклеоид не отделен от цитоплазмы ядерной мембраной.

2.Цитоплазма- сложная коллоидная система, содержащая различные включения метаболического происхождения (зерна волютина, гликогена, гранулезы и др.), рибосомы и другие элементы белоксинтезирующей системы, плазмиды (вненуклеоидное ДНК),мезосомы(образуются в результате инвагинации цитоплазматической мембраны в цитоплазму, участвуют в энергетическом обмене, спорообразовании, формировании межклеточной перегородки при делении).

3.Цитоплазматическая мембранаограничивает с наружной стороны цитоплазму, имеет трехслойное строение и выполняет ряд важнейших функций- барьерную (создает и поддерживает осмотическое давление), энергетическую (содержит многие ферментные системы- дыхательные, окислительно- восстановительные, осуществляет перенос электронов), транспортную (перенос различных веществ в клетку и из клетки).

4.Клеточная стенка- присуща большинству бактерий (кроме микоплазм, ахолеплазм и некоторых других не имеющих истинной клеточной стенки микроорганизмов). Она обладает рядом функций, прежде всего обеспечивает механическую защиту и постоянную форму клеток, с ее наличием в значительной степени связаны антигенные свойства бактерий. В составе - два основных слоя, из которых наружный- более пластичный, внутренний- ригидный.

Основное химическое соединение клеточной стенки, которое специфично только для бактерий- пептидогликан(муреиновые кислоты). От структуры и химического состава клеточной стенки бактерий зависит важный для систематики признак бактерий-отношение к окраске по Граму. В соответствии с ним выделяют две большие группы- грамположительные (“грам+”) и грамотрицательные (“грам - “) бактерии. Стенка грамположительных бактерий после окраски по Граму сохраняет комплекс йода сгенциановым фиолетовым(окрашены в сине- фиолетовый цвет), грамотрицательные бактерии теряют этот комплекс и соответствующий цвет после обработки и окрашены в розовый цвет за счет докрашивания фуксином.

Особенности клеточной стенки грамположительных бактерий.

Мощная, толстая, несложно организованная клеточная стенка, в составе которой преобладают пептидогликан и тейхоевые кислоты, нет липополисахаридов (ЛПС), часто нет диаминопимелиновой кислоты.

Особенности клеточной стенки грамотрицательных бактерий.

Клеточная стенка значительно тоньше, чем у грамположительных бактерий, содержит ЛПС, липопротеины, фосфолипиды, диаминопимелиновую кислоту. Устроена более сложно- имеется внешняя мембрана, поэтому клеточная стенка трехслойная.

При обработке грамположительных бактерий ферментами, разрушающими пептидогликан, возникают полностью лишенные клеточной стенки структуры- протопласты. Обработка грамотрицательных бактерий лизоцимом разрушает только слой пептидогликана, не разрушая полностью внешней мембраны; такие структуры называютсферопластами. Протопласты и сферопласты имеют сферическую форму (это свойство связано с осмотическим давлением и характерно для всех безклеточных форм бактерий).