24. Взаимодействия вирусов с клеткой

Основные этапы взаимодействия вируса с клеткой хозяина.

1.Адсорбция- пусковой механизм, связанный со взаимодействием специфическихрецепторов вируса и хозяина (у вируса гриппа- гемагглютинин, у вируса иммунодефицита человека- гликопротеинgp120).

2.Проникновение- путем слияния суперкапсида с мембраной клетки или путем эндоцитоза (пиноцитоза).

3.Освобождение нуклеиновых кислот- “раздевание” нуклеокапсида и активация нуклеиновой кислоты.

4.Синтез нуклеиновых кислот и вирусных белков, т.е. подчинение систем клетки хозяина и их работа на воспроизводство вируса.

5.Сборка вирионов- ассоциация реплицированных копий вирусной нуклеиновой кислоты с капсидным белком.

6.Выход вирусных частиц из клетки, приобретения суперкапсида оболочечными вирусами.

Исходы взаимодействия вирусов с клеткой хозяина.

1.Абортивный процесс- когда клетки освобождаются от вируса:

- при инфицировании дефектнымвирусом, для репликации которого нужен вирус- помощник, самостоятельная репликация этих вирусов невозможна ( так называемые вирусоиды). Например, вирус дельта (D) гепатита может реплицироваться только при наличии вируса гепатитаB, егоHbs- антигена, аденоассоциированный вирус- в присутствии аденовируса);

- при инфицировании вирусом генетически нечувствительных к нему клеток;

- при заражении чувствительных клеток вирусом в неразрешающих условиях.

2.Продуктивный процесс- репликация (продукция) вирусов:

- гибель (лизис) клеток(цитопатический эффект)- результат интенсивного размножения и формирования большого количества вирусных частиц - характерный результат продуктивного процесса, вызванного вирусами с высокой цитопатогенностью. Цитопатический эффект действия на клеточные культуры для многих вирусов носит достаточно узнаваемый специфический характер;

- стабильное взаимодействие, не приводящее к гибели клетки (персистирующие и латентные инфекции) - так называемаявирусная трансформация клетки.

3.Интегративный процесс- интеграция вирусного генома с геномом клетки хозяина. Это особый вариант продуктивного процесса по типу стабильного взаимодействия. Вирус реплицируется вместе с геномом клетки хозяина и может длительно находиться в латентном состоянии. Встраиваться в ДНК- геном хозяина могут только ДНК- вирусы (принцип “ДНК- в ДНК”). Единственные РНК- вирусы, способные интегрироваться в геном клетки хозяина- ретровирусы, имеют для этого специальный механизм. Особенность их репродукции- синтез ДНК провируса на основе геномной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы с последующим встраиванием ДНК в геном хозяина

25.методы культивирования вирусов

Методы культивирования вирусов

Вирусы не способны к бинарному делению. Они как облигатные внутриклеточные паразиты, требуют для культивирования живые клетки. Это могут быть культуры клеток, куриные эмбрионы, мыши-сосунки и пр.

Культуры клеток. Культуры клеток впервые применили в 20-е годы прошлого столетия. Но только в 1949 г было экспериментально показано, что культуры клеток поддерживают рост вируса полиомиэлита.

Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяются на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Наилучшими являются клетки перевиваемые, позволяющие проводить достаточно много пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток готовят из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью к делению и длительному размножению invitroв определенных условиях. К ним относятся злокачественные клеткиHela, предварительно выделенные из карциномы шейки матки,Hep-3 - из лимфойдной карциномы и нормальные клетки амниона человека, почек обезьян и др.

К полуперевиваемым культурам относят диплойдные клетки человека, представляющие собой клеточную систему, позволяющую проводить до 40-50 пассажей. Диплойдные клетки не претерпевают злокачественного перерождения, чем и отличаются от злокачественных.

Взвесь дезинтегрированных клеток ткани в растворе Хенкса или 199 вносят в чашку Петри (флакон) и оставляют на сутки при комнатной температуре. За это время к стеклу дна прикрепляется монослой клеток, остальные не связавшиеся клетки следует отмывать этими же растворами. Монослой культуры клеток заражают исследуемым материалом, который содержит вирусы. На размножение в культуре клеток вируса указывает цитопатическое действие его на клетки (ЦПД).

ЦПД следует выявлять с помощью методов микроскопии по изменению морфологии данной культуры клеток. Культивирование миксовирусов приводит к слиянию клеток, с образованием синтиция, реовирусы сморщивают и деструктируют клетки. Аденовирусы - агрегируют клетки. Вирусы кори, паротита и парагриппа индуцируют образование гигантских клеток - многоядерных. Риновирусы вызывают образование отдельных участков округлых клеток с отростками.

Некоторые вирусы (краснуха) не вызывают видимых ЦПД, но их определяют по интерференции другого вируса, который обладает способностью вызывать дегенерацию инфицированных клеток. ЦПД вирусов просматривают в динамике. Энтеровирусы могут вызывать ЦПД на 1-2 сутки, другие вирусы на 4-6 сутки.

Индикацию вирусов в культуре клеток проводят методами: гемагглютинации, ИФА, гемадсорбции, нейтрализации и пр.

Метод гемадсорбции предполагает внесение в культуру клеток, зараженную вирусом, взвесь эритроцитов. После отмывания культуры клеток 85 % раствором хлорида натрия все эритроциты, кроме адсорбированных на поверхности пораженных клеток, отмываются.

Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод негативных бляшек Дюльбеко. Культуру клеток заражают вирусом и покрывают тонким слоем агара. После инкубации на поверхности агара появляются просветленные участки определенной формы (бляшки) на розовом фоне, представляющие собой участки погибших клеток в сплошном монослое культуры клеток. Титр вируса выражается числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.

Куриные эмбрионы.Для получения разных препаратов или чистых культур вирусов используют 8-12 дневные куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы в условиях асептики заражают в 3 полости:амниотическую, алантоисную и желточный мешок.

Скорлупу над воздушной камерой обрабатывают 70 % спиртом и обжигают, а затем протирают скорлупу 2 % раствором йода.

Для заражения в алантоисную полость в скорлупе над воздухом проделывают отверстие. Шприцем вводят в него 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 см дальше воздушной подушки. Отверстие в скорлупе заливают парафином.

Заражение в хорион-алантоисную оболочку. Используют эмбрионы 10-12 дневного возраста. Яйцо просвечивают в свете и выбирают бессосудистую область, отмечают локализацию воздушного мешка. Делают искусственный мешок над отмеченным местом, затем снимают скорлупу острым инструментом, освобождают наружную оболочку, которую отслаивают осторожным надавливанием. Делают второе отверстие у края воздушного мешка. Через это отверстие отсасывают воздух и хорион-алантоисная оболочка отслаивается от наружной оболочки. Заражение вируссодержащим материалом (0,1-0,2 мл) делают в оболочку хорион-алантоиса.

Заражение в амниотическую полость. Используют 7-14 дневные куриные эмбрионы. После отслоения хорион-алантоисной оболочки, расширяют отверстие с помощью пинцета, захватывая амниотическую оболочку. Ее выводят через хорион-алантоисную оболочку. Инокулят вводят через эту оболочку непосредственно в амниотическую полость.

Заражение в желточный мешок. Используют 3-8 дневные эмбрионы. В этом возрасте желточный мешок занимает почти всю полость яйца.

Скорлупа обрабатывается как описано выше, делают отверстие в воздушном мешке и вируссодержащий материал вводят в мешок желточный, непосредственно.

Наблюдения за эмбрионами начинают вести через 24-48 ч инкубации при 37⁰С.

Вскрытие куриного эмбриона производят через 48-72 ч инкубации при 37⁰ С. После обработки спиртом и 2 % раствором йода скорлупу рассекают ножницами немного выше границы воздушной камеры, наклоняя яйцо, чтобы скорлупа не попала в полость

Снимают оболочку и рассматривают хорион-алантоисную оболочку, отмечая очаги поражения.

После вскрытия алантоисной оболочки отсасывают алантоисную жидкость, разливают в пробирки или лунки полистироловых планшет по 0,5 мл. Затем добавляют 0,2 мл 1 % взвеси суспензии отмытых куриных эритроцитов, выдерживают при комнатной температуре до 1 ч.

Учитывают результаты реакции:выраженная гемагглютинация - на ++++ креста, тонкая пленка склеившихся эритроцитов +++, наличие просветов в пленке ++, хлопьевидный осадок (-). Наличие гемагглютинации указывает на присутствие вируса в исследуемом материале.

Лабораторные животные. В основу открытия первых вирусов был положен принцип фильтруемости через бактериальные фильтры (1902).

Макс Тейлор положил начало современному этапу работ в вирусологии, основанное на использовании животных - мышей. В 1948 г Долдофор и Сойклаз применили в работе с вирусами мышей-сосунков.

Для лабораторных исследований обычно применяют белых мышей-сосунков.

А также крыс хлопковых, кроликов, хомяков, обезьян и пр.

Сущность метода состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в эмбрионах или культуре клеток.

К недостаткам относят возможность контаминации животных другими инфекциями, а также не последующее заражение культур клеток для выделения чистой культуры.

Подготовка материала.Жидкие материалы, не содержащие в норме бактерий (кровь, спинномозговая жидкость, сыворотка) могут быть использованы для заражения животных в нативном виде.

Ткани промывают в стерильной воде, нарезают на мелкие куски и измельчают. Затем добавляют растворитель до 10-20 % взвеси. Суспензию центрифугируют при 2000 оборотов в мин в течение 10 мин. Для заражения используют надосадок.

Если материал содержит бактерии (носоглоточные смывы, фекалии, насекомые и пр.), то они должны быть удалены: с помощью антибиотиков, фильтрования через фарфоровые свечи, дифференциального ультрацентрифугирования и пр.

Экспериментальное заражение животных

Экспериментальное заражение животных в лабораторной практике имеет большое значение. Перед опытом их взвешивают, измеряют температуру.

Заражение животных интрацеребральное. Применяют для выделения нейротропных вирусов. Мышей заражают группами по 6 штук, перед заражением их наркотизируют и материал в количестве 0,03 мл вводят в мозг, несколько выше орбитального бугра. За ними ведут наблюдение 2-4 недели. Если животные погибают за этот срок, то мозг и кровь из сердца подвергают бактериологическому исследованию для исключения бактериального загрязнения. Выживших животных забивают и исследуют органы на вирусы.

Интраназальное заражение животных. Наркотизируют животных, материал вводят с помощью капиллярной пипетки в носовые ходы каплями. В дальнейшем получают органы погибших или забитых животных и исследуют их вирусологическими и др. методами, включая гистологию срезов органов.

Подкожный способ заражения. Место инъекции дезинфицируют, предварительно удалив волосы. Кожу захватывают в складку, вводят в нее иглу и медленно впрыскивают материал. Затем складку отпускают, накладывают на место укола вату, смоченную в дез.растворе, быстро извлекают иглу. Уколы делают в область бедра (кроликам), мышам и крысам - в поясницу у корня хвоста.

При внутримышечном способематериал вводят кроликам в мышцу бедра.

Внутрикожный способ. В толщу кожи вводят 0,1-0,2 мл материала туберкулиновым шприцем. На месте введения образуется пузырь.

Внутрибрюшинный способ. Животное держат вниз головой, инъекцию тупой иглой делают в нижнюю часть живота, сбоку от средней линии. Сначала вводят иглу под острым углом, проколов кожу, иглу поворачивают под прямым углом. Толчкообразным движением прокалывают брюшную стенку, при этом ощущается провал в полость.

Внутривенное введение. Кроликам вводят материал в ушную вену. Сдавливают корень уха, чтобы набухли вены. Можно потереть кожу ксилолом и вены будут виднее. После прокола вены иглой, сдавливание корня уха прекращают, жидкость медленно вливают в вену.

Вскрытие животных. Животное умерщвляют эфиром или хлороформом.

В противочумной практике их опускают при помощи щипцов в дез.раствор для уничтожения эктопаразитов и обезвреживания кожи, вынимают и кладут на сетку, чтобы стекал дез.раствор, а затем переносят животное на препаровальный столик. Мышей и морских свинок вскрывают на доске.

Ножницами разрезают кожу от лобка до нижней челюсти и делают разрезы к лапкам. Кожу отпрепаровывают и осматривают.

Паховые лимфоузлы, отрезают часть от них и делают мазок-отпечаток на предметное стекло, а остальную часть засевают в бульон. Делают разрез ножницами грудной клетки, захватив пинцетом отросток мечевидный, ребра прорезают с обеих сторон и перерезают ключичные кости. Осматривают лимфоузлы, легкие, сердце. Часть органов захватывают пинцетом и отрезают, разрезанной поверхностью делают мазки-отпечатки и засевают кусочек органа в жидкие питательные среды. Далее приподнимают пинцетом брюшину у нижнего края и разрезают ножницами снизу вверх.

Проводят осмотр органов и лимфоузлов, а затем с помощью пинцета и ножниц отрезают кусочки органов, делают мазки-отпечатки и кусочки засевают в жидкие питательные среды.

Животных после вскрытия, павших либо погибших во время опыта, следует автоклавировать или сжигать в крематории. Зараженные банки, где держали грызунов, следует обработать 10 % хлорной известью. Подстилку и остатки корма сжигают

26. Антибиотики

Открыл Флемминг в 1928г, затем были созданы синтетические. Это продукты жизнедеятельности живых , а т/же синтетические в-ва, обладающие способностью убивать или тормозить рост и размножение мкin vivo et in vitro. Известно >1000 антибиотиков и >2 тыс НМС, способных тормозить рост и размножение. Но выбор АБ ограничен, т.к. большая их часть ТОКСИЧНЫ для МК.

По МЕХАНИЗМУ ДЕЙСТВИЯ выделяют: БАКТЕРИЦИДНЫЕ (убивают) и БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКИЕ (тормозят рост и размножение, после устранения АБ рост и размножение возобновляются).

ТРЕБОВАНИЯ к АБ:

1. Minвлиять наМК.

2. Maxантимикробный эффект в условиях МК.

3. Медленно развивающаяся зависимость со стороны мк.

4. Хорошо растворяться и быть устойчивы в обычных услових хранения.

5. Сохранять антимикробное действие вне зависимости от среды.

6. Антимикробное действие должно проявляться вне зависимости от того, где находится мк– внутри или вне.

7. Желательно, чтобы обладал иммуностимулирующим действием.

КЛАССИФИКАЦИЯ:

1. По происхождению:

1. продуцируются БАКТЕРИЯМИ (грамицидин, полимиксин) – борьба м/у мкв естественных условиях

2. синтезируются АКТИНОМИЦЕТАМИ (стрептомицин, неомицин) – род Streptomycesосновной продуцнет антибиотиков.

3. Продуцируются ПЛЕСНЕВЫМИ ГРИБАМИ (пенициллин, циклоспорин) – род Penicillium, первый антибиотик.

4. РАСТИТЕЛЬНОГО происхождения (аллицин)

5. ЖИВОТНОГО происхождения (лизоцим, интерферон)

2. По спектру антимикробного действия:

1. УЗКИЙ спектр действия – только на гр+ или гр–

2. ШИРОКОГО АНТИБАКТ спектра действия – на гр+ и гр–

3. ШИРОКОГО спектра действия – на Б!!, + хламидий, риккетсий, спирохет

4. АНТИГРИБКОВОГО действия (нистатин, леваин)

5. Действующие на МИКОБАКТЕРИИ – лечат tbc(стрептомицин)

6. ПРОТИВООПУХОЛЕГО действия – действуют на синтез НК

7. с ИММУНОСУПРЕССИВНЫМ действием – при пересадке органов.

3. По механизму действия:

1. Подавляющие синтез СТЕНКИ мк(пенициллин). Если мкпереходит вL–форму, АБ не эффективен.

2. Нарушающие ПРОНИЦАЕМОСТЬ мбны, оказывают бактерицидное действие (нистатин, грамицидин).

3. Нарушающие СИНТЕЗ БЕЛКА (эритромицин, тетрациклин) – действуют только на 70Sрибосомы.

4. Ингибирующие ДЫХАТЕЛЬНУЮ ЦЕПЬ – бактерицидное (цианиды).

5. Нарушающие СИНТЕЗ НК – не только на Б!!, но и на В!!, раковые (бактериостатическое).

Устойчивость мк к АБ делится на:

НЕГЕНЕТИЧЕСКАЯ: 1) утрата рецепторов к АБ на поверхности Б!!

2. ↓ метаболической активности АБ, действующие на синтез не работают

3. если микроб расположен внутри хозяина, то многие АБ не могут на них воздействовать, т.к. не проникают вМК

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ– проявляется чаще. Обусловлена следующими факторами:

1. НЕХРОМОСОМНЫЕ – плазмиды (R-плазмида), придающие устойчивость. Чем больше генов в плазмиде, тем более устойчивы Б!!

R-плазмида содержит гены, контролирующие синтез ферментов, которые разрушают антибиотик (пенициллаза или бета–лактамаза). Плазмиды передаются в процессе конъюгации в пределах вида или рода.

2. ХРОМОСОМНЫЕ – определяются Мт в структуре самой хромосоме. В основном они вызываются транспозонами и IS–элементами. Если в популяции появляется устойчивый мутант, то он выживает и активно размножается, а остальные гибнут.При лечении не рекомендуется использовать один и тот же АБ, т.к. с устойчивой инфекцией бороться гораздо сложнее.

КОСВЕННАЯ РЕЗИСТИВНОСТЬ – при заражении смешанной инфекцией устойчивые мкбудут разрушать АБ, предотвращая его воздействие на чувствительные мк(они будут выжывать).