Материалы Х конференции 2015

РОЗРОБКА КОДОМІНАНТНОЇ СИСТЕМИ МАРКЕРІВ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ГЕНА GPC-B1 В ГІБРИДАХ МʼЯКОЇ ПШЕНИЦІ

Скриник М. М.1, Похилько С. Ю.1,2, Степаненко А. І.2

1Національний технічний університет України «Київський політехнічний інститут», факультет біотехнології і біотехніки, пр. Перемоги, 37, Київ, 03056 2Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, вул. Академіка Заболотного, 148, Київ, 03680

е-mail: pokhylko8@gmail.com

На пшеницю припадає 25% світового білкового харчування (FAOSTAT, 2014), також, вона являється важливим джерелом мікроелементів. Ген Gpc-b1 був привнесений в геном м‟якої пшениці Triticum aestivum від Triticum turgidum ssp. dicoccoides в складі цілої 6В

хромосоми, що відповідає за високий рівень накопичення білку, мікроелементів Fe і Zn (Cakmak et al., 2004, Distelfeld et al., 2007), а також прискореного старіння листя пшениці

(Uauy et al., 2006).

Метою роботи була розробка кодомінантної системи молекулярно-генетичних маркерів для визначення наявності гена Gpc-b1 від T. turgidum ssp. dicoccoides у гібридах м‟якої пшениці.

Виділення загальної рослинної ДНК проводили ЦТАБ-методом (Stewart et al., 1993) із зернівок пшениці – ліній, отриманих від схрещування сорту Куяльник і носія гена Gpc-b1 Triticum turgidum ssp. dicoccoides, наданих Рибалкою О. І.

Наявність гена Gpc-b1 від Triticum turgidum ssp. dicoccoides ми встановлювали за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з парою праймерів UHW89-BF/UHW89R, обраною згідно статті (Uauy et al., 2006).

Параметри апмліфікації були наступними: денатурація 94°С – 4 хв., 10 циклів: денатурація 94°С – 30 с, ренатурація 65°С – 30 с (зниження температури на 1°С в кожному циклі), елонгація 72°С – 20 с, потім 25 циклів: денатурація 94°С – 30 с, ренатурація 55°С – 20 с, елонгація 72°С – 20 с; завершальна елонгація 72°С – 5 хв. Кінцева концентрація праймерів у реакції – 0,5 мкМ. Наявність амплікону розміром 122 п.н. свідчить про присутність гена Gpc-b1 від T. turgidum ssp. dicoccoides, ампікон 126 п.н. – про відсутність гена, присутність двох фрагментів показує гетерозиготний стан гібриду.

Продукти ПЛР розділяли та ідентифікували за допомогою електрофорезу в 2,5%-му агарозному гелі з бромистим етидієм в якості фарбника.

Розробленою молекулярно-генетичною системою маркерів було перевірено 59 гібридів м‟якої пшениці. Було показано, що 34 зразки несли ген Gpc-b1 від T. turgidum ssp. dicoccoides, 11 зразків не містили його і 14 зразків були гетерозиготні, тобто несли гени від T. turgidum ssp. dicoccoides і від T. aestivum. Гібриди, позитивні за геном Gpcb1 від T. turgidum ssp. dicoccoides, були відібрані для розмноження з метою подальших досліджень.

В результаті роботи була розроблена кодомінантна система молекулярних маркерів, яка дає можливість визначити наявність гена Gpc-b1 від T. turgidum ssp. dicoccoides, що є дуже цінним у селекції для отримання нових високоякісних сортів м‟якої пшениці з підвищеним вмістом білку і мікроелементів.

Summary. One of the most important problem in wheat selection is increasing of protein and micronutrients. The optimal codominant system of molecular marker was developed to identify Gpc-b1 from T. turgidum ssp. dicoccoides gene, which is responsible for high accumulation of protein, micronutrients Fe and Zn. The Gpc-b1 gene from T. turgidum ssp. dicoccoides was determined in 34 hybrid of bread wheat. Geterogenety of the material was observed in 14 samples. Sample which contained the gene Gpc-b1 were planted in the field.

МАТЕМАТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ МЕТАБОЛИЗМА ПОЛИАМИНОВ В КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ

Ткаченко А. Б.

Донецкий Национальный Университет, биологический факультет, кафедра человека и животных, ул. Фрунзе 4, г. Винница, Украина

e-mail: nencetkachenko@gmail.com

Полиамины рассматриваются в качестве основных клеточных метаболитов, в связи с их участием в различных физиологических процессах, включая регуляцию экспрессии генов, трансляцию, пролиферацию клеток, модуляцию сигнализации клетки, стабилизацию мембран и др. Кроме того, полиаминный гомеостаз является необходимым для выживания всех клеток организма, и его дерегуляция ответственна за такие процессы, как рак и нейродегенеративные расстройства. Отмечено, что некоторые пациенты с гепатитом, циррозом и абсцессом печени имеют высокую концентрацию полиаминов в сыворотке или моче. Важная роль в регуляции уровней полиаминов в клетке принадлежит орнитиндекарбоксилазе, катализирующей синтез путресцина. Путресцин является исходным материалом для биосинтеза спермидина и спермина, для которых необходим метионин и АТФ. Специфичной чертой метаболизма полиаминов в органах и тканях человека, является наличие цикла интерконверсии, в ходе которого происходит взаимопревращение полиаминов друг в друга. В процессе обратного преобразования спермина и спермидина в путресцин усиливается продукция и накопление в тканях избыточных количеств перекиси водорода и 3-аминопропиональдегида, являющихся факторами клеточного повреждения и апоптоза.

В связи с трудностями изучения метаболизма полиаминов, исследования были проведены в пределах математической модели. Преимущество данного подхода заключается в том, что он позволяет выяснить поведение системы в зависимости от кинетических характеристик, молекулярных свойств ферментов в области реальных внутриклеточных концентраций метаболитов. В данной работе предлагается математическая модель полиаминного метаболизма, связанного с циклом метионина. Объектом исследований послужили клетки печени. Кинетические константы и концентрации метаболитов взяты из литературных источников и баз данных (Caso еt al., 2006, Reed, et al., 2004, Desser et al., 1980). Модель включает 15 дифференциальных уравнений и 15 метаболитов, 5 из которых внешние.

С использованием модели изучено:

-влияние активностей орнитиндекарбоксилазы, S-аденозилметиониндекарбоксилазы, спермидин/спермин ацетилтрансферазы на концентрации полиаминов;

-поведение модели и уровень полиаминов в ответ на изменение концентраций метионина и 5-метилтетрагидрофолата. Уровень последних в значительной степени определяется наследственной генетической изменчивостью или особенностями питания.

Основываясь на данных, мы можем заключить, что эффект на метаболизм полиаминов оказывает концентрация метионина, поступающего в организм.

Summary. Polyamines are considered as essential compounds in living cells, since they are involved in cell proliferation, transcription, and translation processes. Furthermore, polyamine homeostas is necessary to cell survival, and its deregulation is involved in relevant processes, such as cancer and neurodegenerative disorders. In this work, we propose a mathematical model of

polyamine metabolism and methionine cycle from kinetic constant sand both metabolite and enzyme levels extracted from bibliographic sources. Based on data we can concluded that the effect on the metabolism of polyamines in the concentration methionine, which arrives in an organism. Influence of activities of an ornithinedecarboxylas, S-adenosylmethionine, spermidine/spermine acetyltransferase on concentration of polyamines is shown.

Научный руководитель: Доценко Ольга Ивановна, к.х.н., доцент.

SH3 DOMAINS OF ADAPTOR PROTEIN INTERSECTIN 1 INTERACT DIFFERENTLY WITH TWO DISTINCT ISOFORMS OF CYTOSKELETAL PROTEIN STOP

Onyshchenko K. V., Pohrebniak N. A., Vychikov V. V., Morderer D. Ye.

Institute of Molecular Biology and Genetics, 150 Zabolotnogo St., Kyiv, Ukraine, 03680 e-mail: katty.onishenko@gmail.com

Intersectin 1 (ITSN1) is an evolutionary conserved multidomain adaptor protein that is involved in clathrin-mediated endocytosis, cell signaling and cytoskeleton remodeling. There is increasing evidence that this protein is associated with development of some neuropathies, namely

Down syndrome and Alzheimer‟s disease. The high levels of ITSN1 in neurons and existence of its neuron-specific isoforms suggest that ITSN1 is important for neurons function. Indeed, it has been shown that ITSN1 is involved in synaptic vesicle recycling and dendritic spine development, but there is no comprehensive description of its role in neuron function yet.

One of the proteins that interact with ITSN1 in neurons is microtubule-associated protein STOP (Morderer, 2012). Among many different microtubule effectors, STOP (for stable tubule only polypeptide) was found to be the major factor able to induce microtubule cold-stability in neurons (Andrieux, 2002). In mammals, different isoforms of STOP protein arise from alternative mRNA splicing and different transcription initiation sites within a single gene (Aguezzoul, 2003).

The first isoform characterized in adult brain is N-STOP (120 kDa) (Bosc, 1996), encoded by four exons. It has been shown that the suppression of STOP in neurons induces a complete loss of microtubule stability (Andrieux, 2002). The main STOP isoform in fibroblasts is F-STOP (42 kDa), which is encoded by part of exon 1 and by exon 2 (Denarier, 1998).

In order to study interaction of STOP isoforms with intersectin 1 we cloned N- and F-STOP isoforms in a pcDNA™4/HisMaxA and B vector respectively. The 293 cell line was transiently transfected with obtained constructs using the TurboFect Transfection Reagent and processed 24 h after transfection. To explore the domains of ITSN1 responsible for binding of STOP, we performed in vitro binding assays with individual ITSN1 GST-SH3 domains. Briefly, GST-SH3 domains were immobilized on glutathione-sepharose and incubated with lysate of transfected cells. Bound proteins were analyzed by Western blot using anti-Omni antibodies. GST and GST-fused SH3 domains were stained with Coomassie brilliant blue stain.

GST pull-down assay revealed that N-STOP binds the ITSN1 SH3A domain with high affinity, SH3D and SH3E domains with slightly lower affinity and SH3B and SHC domains with much lower affinity.

In contrast to N-STOP, interaction between F-STOP and intersectin 1 is mediated by SH3A and SH3D domains of intersectin 1. Both domains bind F-STOP with similar affinity. Considering the fact that F-STOP matches the central part of N-STOP, we assume the existence of several binding sites for SH3 domains within N-STOP molecule. At least one of them is located in central region of N-STOP and is shared with F-STOP molecule, while other one or several sites with increased affinity to SH3A domain are located in either its C- or in N-terminus. Since the SH3A domain of intersectin 1 is crucial for its protein-protein interactions in neurons (Tsyba, 2008) we are

interested in ascertaining of N-STOP SH3A-binding sites location and identifying the key motifs responsible for this interaction.

Authors would like to thank senior researcher of the Institute of Molecular Biology and Genetics NASU Dr. Inessa Skrypkina for the supervision of this work.

OBTAINING RABBIT ANTIBODIES TO RECOMBINANT SH3A FRAGMENT OF

ADAPTER PROTEIN RUK

Yatsenko M.1, Shabas N.1, 2, Horak I.2, Pasichnyk H.2

1Taras Shevchenko National University of Kyiv, ESC “Institute of Biology”, Department of

Biophysics, 2 Glushkov Ave, Kyiv, Ukraine

2Palladin Institute of Biochemistry of NAS of Ukraine, Cell Signaling Laboratory, 9 Leontovicha str., Kyiv, Ukraine, 01601

E-mail: mykola.v.yatsenko@gmail.com

Ruk/CIN85 belongs to a family of ubiquitously expressed adaptor proteins containing three SH3 domains (SH3A, SH3B, SH3C), a proline-rich region and a coiled-coil domain. By binding to numerous proteins they assemble multimeric complexes implicated in cell-specific signals controlling T-cell activation, kidney glomeruli function or apoptosis in neuronal cells. Ruk also associates with accessory endocytic proteins, components of the actin cytoskeleton as well as other adaptor proteins involved in receptor tyrosine kinase (RTK) signaling. These interactions enable Ruk/CIN85 to function within a network of signaling pathways that co-ordinate critical steps involved in downregulation and degradation of RTKs (Dikic, 2002). Generation of monospecific polyclonal rabbit antibodies to the SH3A fragment of Ruk will provide a valuable tool for further research of Ruk adapter protein, which is a promising target for drugs.

After preparing competent cells of E. coli BL21 (Nishimura et al., 1990), they were transformed by GE Healthcare™ pGEX-2T GST expression vector with insertion of nucleotide sequence of Ruk SH3A fragment. Expression of target protein in selected tranformants was induced by addition of IPTG in Luria-Bertani media (to 1 mM). The efficiency of expression was determined by SDS-PAGE. Expressing bacterial culture was cultivated for 4 hours at 37°С.

Bacteria were lysed by ultrasonic disintegration. Recombinant GST-fused SH3A fragment was purified from lysates by affinity chromatography. A GSTrap column contained glutathionesepharose was used. The concentration of purified protein was determined spectrophotometrically with bicinchoninic acid assay. It was 11 mg/ml. Molecular weight was determined by SDS-PAGE. Immunization of male rabbit with recombinant SH3A fragment of protein Ruk was carried out further. After 28 days, immune serum was obtained and monospecific polyclonal antibodies were purified by affinity chromatography on column. We used CNBr 4B-Separose with covalently conjugated Ruk as recommended by the manufacturer (Sigma-Aldrich). In order to determine the optimal dilution, the obtained anti-SH3A Ruk antibodies were tested by ELISA. It was found that results of positive controls in qualitative analysis by ELISA with using antibody at dilutions up to 1×10-5 (inclusive) were significantly different from the negative control. To assess the affinity of the obtained anti-SH3A Ruk antibodies in Western blotting, it was performed on lysates from sublines 4T1 cells with different levels of Ruk expression (overexpression, no expression, normal expression). According to the results, the obtained antibodies were suitable for using in Western blot assay.

Monospecific polyclonal antibodies to the SH3A fragment of adapter protein Ruk may be applied in immunoassay techniques (Western blot, ELISA, etc.), thus allowing to analyze proteinprotein interactions of Ruk adapter protein, its participation in cell signaling pathways, semiquantitatively determine the level of its intracellular content.

Authors appreciate their scientific supervisor Petukhov D. M., PhD for the invaluable help and guidance.

БІОМЕДИЦИНА ФІЗІОЛОГІЯ ЛЮДИНИ ТА ТВАРИН

БИОМЕДИЦИНА ФИЗИЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

BIOMEDICINE

HUMAN AND ANIMAL PHYSIOLOGY

МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНА ДИФЕРЕНЦІАЦІЯ ЛІМФОЇДНОГО ДИВЕРТИКУЛА ПОРОЖНЬОЇ КИШКИ У ГУСЕЙ В ОНТОГЕНЕЗІ

Бирка О. В.

Харківська державна зооветеринарна академія, факультет ветеринарної медицини, кафедра анатомії і гістології імені професора Т. Г. Цимбала, вул. Академічна, 1, смт. Мала Данилівка, Дергачівський р-н, Харківська обл., Україна.

e-mail: histology@ukr.net

Принцип диференціації, як основний принцип філогенетичного формотворення, був встановлений Г. Мільн-Едвардсом (1851) і вважається основним принципом розвитку, оскільки саме таким шляхом виникає все нове (Шмальгаузен, 1935). Диференціація відбувається в одному напрямку – від менше диференційованої до більше диференційованої структури (Улумбеков, Челышев, 2001) та веде до розподілу цілого на частини з встановленням притаманних їм функцій (Ковтун, 2005). При диференціації відбуваються морфофункціональні перетворення органів, прикладом чого є диференціація первинної кишки на органи апарата травлення (Яблоков, Юсуфов, 2006).

Нами досліджено морфофункціональні метаморфози в процесі розвитку дивертикула порожньої кишки у гусей великої сірої породи, який у постембріональний період онтогенезу приймає на себе функцію периферичного органу імунної системи. У ембріональний період закладка лімфоїдного дивертикула у вигляді жовткової протоки відбувається на антимезентеріальній поверхні петлі порожньої кишки. Жовткова протока з‟єднує просвіт порожньої кишки з порожниною жовткового мішка і виконує певну роль у постачанні поживних речовин зародку (Рагозина, 1961). Клітинний склад слизової оболонки жовткової протоки на 27-у добу інкубації свідчать і про початок виконання органом кровотворної функції. Після вилуплення гусенят жовткова протока диференціюється у постійний лімфоїдний дивертикул порожньої кишки. З віком гусей найбільш суттєві перетворення мають місце у слизовій оболонці органу, проявом яких є зміни клітинного складу епітелію, утворення крипт, формування власної пластинки і підслизової основи, активізація розвитку лімфоїдної тканини та становлення певних форм її організації. Лімфоїдна тканина у слизовій оболонці лімфоїдного дивертикула виявляється в добовому віці гусенят, а з 7-добового – ще й у м‟язовій і серозній оболонках органу. У 21-добовому віці гусенят настає повна морфофункціональна зрілість лімфоїдного дивертикула, як периферичного органа імуногенезу, ознакою якої є наявність у стінці органу дифузної лімфоїдної тканини, передвузликів, первинних та вторинних лімфоїдних вузликів, розвиток яких відбувається за участі макрофагів, еозинофільних лейкоцитів, ендокринних і тучних клітин. У лімфоїдному дивертикулі 3-місячних гусенят лімфоїдна тканина займає максимальну площу (83,77%). У стінці жовткової протоки плодів та лімфоїдного дивертикула гусей першого тижня життя індекс диференціації лімфоцитів знаходиться у межах 0,48±0,02-0,67±0,01, що вказує на домінування клітинних механізмів імунітету. У гусей віком від 14 діб до 2-х років індекс диференціації більший за одиницю (1,07±0,03-1,56±0,02), що є показником переважання гуморальних механізмів імунітету. У гусей 3-5-річного віку індекс диференціації близький до одиниці (0,90±0,06/0,07), що є ознакою збалансованого стану імунних реакцій з незначним переважанням клітинних механізмів.

Summary. The thesis devotes to the investigations of morphofunctional differentiation of diverticulum jejunum in geese of big grey breed at ontogeny. The diverticulum jejunum in postembryonic period of geese acts as a peripheral organs of the immune system. In the lymphoid tissue of diverticulum jejunum wall has been determined the content, distribution and quantative ratio of lymphocytes.

Науковий керівник: кандидат ветеринарних наук, доцент кафедри анатомії і гістології ім. професора Т. Г. Цимбала Кущ М. М.

УРАЖЕННЯ ДІТЕЙ TOXOCARA CANIS: КЛІНІЧНА СИМПТОМАТИКА ТА ІНСТРУМЕНТАЛЬНО-ЛАБОРАТОРНІ ПОКАЗНИКИ

Богдан Н. В., Кадельник Л. О.

ВДНЗ України «Буковинський державний медичний університет», Кафедра фармацевтичної ботаніки та фармакогнозії, 58000, м. Чернівці, Театральна площа, 2, Україна.

e-mail: fbf@bsmu.edu.ua

Токсокароз − зооантропонозне паразитарне захворювання, що спричиняється міграцією личинок аскаридат собак (Toxocara canis) в органах і тканинах людини, характеризується тривалим рецидивуючим перебігом і поліорганними ураженнями алергічної природи (Софьина, 2013). За даними зарубіжної літератури захворюваність на токсокароз зросла за останні 50

років на 300% (Shakir Al-Hassnawi Alaa Tareq, 2013). Останніми роками в Україні спостерігається чітка тенденція до збільшення числа виявлених хворих на токсокароз (Захарчук, 2012; Юхименко та ін., 2012).

При проведенні дослідження використані клініко-лабораторні, біохімічні, інструментальні, епідеміологічні, епізоотологічні, санітарно-гельмінтологічні, імунологічні, серологічні методи з відповідною статистичною обробкою отриманих результатів.

Найчастіше хворі скаржилися на підвищену втомлюваність (59,90%), головний біль (30,08%), запаморочення (45,25%), відчуття тяжкості і/або біль в епігастральній області (40,92%) і правому підребер'ї, (67,48%), диспепсичні прояви у вигляді нудоти (30,62%), зниження апетиту (44,72%), закрепи (24,66%), проноси (21,14%), метеоризм (41,19%). Прояви диспепсичного синдрому різного ступеня вираженості відзначалися у половини обстежених. У 46,61% хворих на токсокароз були скарги на кашель, частіше сухий. При об‟єктивному обстеженні у 84,25% хворих відзначалася блідість шкірних покривів, у 14,36% − субіктеричність склер, у 44,72% хворих захворювання супроводжувалося різноманітного типу рецидивуючими висипами на шкірі. Елементи висипів мали макуло-папульозний характер і локалізувалися на тулубі або на тулубі та верхніх кінцівках одночасно. Підвищення температури тіла частіше спостерігалося у 55,28% хворих. При огляді у 196 (53,12%) дітей відзначався локальний біль у правому підребер'ї та/або в ділянці проекції жовчного міхура з іррадіацією в праве плече, шию, під лопатку і в поперекову ділянку. У 45,53% хворих обмежений біль при перкусії і пальпації визначався переважно в епігастральній ділянці, рідше (22,49%) − навколо пупка. Наліт на слизовій язика зустрічався у 33,88% хворих. При пальпації в правому підребер'ї печінка визначалася біля краю реберної дуги у 29,27% хворих, а у 70,73% нижній край печінки виступав з-під краю реберної дуги на 2-3 см. При ультразвуковому дослідженні органів черевної порожнини у 61,3% хворих зі скаргами на біль у правому підребер'ї виявлені ознаки хронічного холециститу, у 42,9% хворих-гепатохолециститу, холецистопанкреатиту, гепатиту. У 20 (5,42%) хворих виявлена спленомегалія і в одного − ознаки гастродуоденіту. Легеневий синдром відмічався у 48,27% хворих. На фоні субфебрильної температури, рідше фебрильної, у хворих відмічалися кашель, ядуха, біль у грудній клітці. Рентгенологічно у 50,94% хворих визначалося посилення легеневого рисунка за рахунок периваскулярних і перибронхіальних ущільнень, інфільтративні зміни. Гепатобіліарний синдром виявлений у 69,34% хворих на токсокароз. У 72,37% хворих спостерігалися неврологічні порушення різного ступеня вираженості, які клінічно проявлялися у вигляді головного болю, що виникав частіше до кінця дня і/або після перенапруження, підвищеної втомлюваності й дратівливості. У 41,7% хворих виявлено синдром вегетосудинної дистонії. Зміни в емоційній сфері виявлялися в різній формі неврастенічного синдрому (антено-депресивного, астено-фобічного, астено-іпохондричного), а також істеричним синдромом і невротичними реакціями.

Серед клініко-лабораторних показників у хворих на токсокароз найчастіше відзначалися еозинофілія (100%), лейкоцитоз (80,30-93,33%), прискорена ШОЕ