69

97УДК 575

ББК 28.04

П 20

Ответственный редактор

доктор химических наук Ю.А. Берлин

Рецензенты:

кандидат химических наук В.Г. Коробко

доктор биологических наук В.А. Гвоздев

Патрушев Л.И.

Экспрессия генов. – М.: Наука, 2000. – 000 с., ил.

ISBN5-02-001890-2

В монографии рассмотрены современные представления о строении и механизмах функционирования генов прокариот и эукариот, а также основные методы их исследования. Книга состоит из двух частей. В первой части обсуждаются структура генома прокариотических и эукариотических организмов, а также механизмы транскрипции, трансляции, репликации, репарации и их регуляции. Во второй части монографии рассмотрены принципы основных методов, используемых в исследованиях генов. Главное внимание уделено современным методам генной инженерии. Обсуждаются наиболее важные аспекты развития современной молекулярной генетики в исследованиях направленного мутагенеза и белковой инженерии, антисмысловых РНК, рибозимов и дезоксирибозимов, трансгеноза и генотерапии, а также достижения в ДНК-диагностике и ДНК-типировании и изучении генома человека.

Для научных работников, аспирантов и студентов, специализирующихся в области химии и биологии.

ТП-97-П-№ 123

Patrushev L.I.

Gene Expression. – Moscow: Nauka, 2000. – 000 p., il.

ISBN 5-02-001890-2

This monograph consisting of two parts presents a comprehensive view of the structure and functioning mechanisms of genes for prokaryotes and eukaryotes as well as the basic methods used for their studies. Its first part discusses the genome structure of prokaryotic and eukaryotic organisms, also covering the mechanisms of transcription, translation, replication, DNA repair and their regulation. The second part of the monograph deals with the principles of the techniques employed in the gene research. The book devotes particular attention to current genetic engineering tools. It embraces the key aspects of recent developments of molecular genetics studies on site-directed mutagenesis, protein engineering, antisense RNA, ribozymes and deoxyribozymes, transgenosis and gene therapy, DNA diagnostics and genotyping human genome.

The book will act as authoritative references for researchers, postgraduates, and students specializing in chemistry and biology.

ISBN5-02-001890-2

© Издательство "Наука", 2000

ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие редактора 9

Предисловие автора 12

Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17

ВВЕДЕНИЕ 18

Глава 1. ГЕНОМ 25

1.1. Гены и хромосомы 27

1.2. Геном прокариот 30

1.2.1. Геном вирусов 31

1.2.2. Нуклеоид бактериальной клетки 32

1.2.3. Геном архебактерий 35

1.2.4. Минимальный размер генома одноклеточных организмов 37

1.3. Геном эукариот 40

1.3.1. Последовательности нуклеотидов эукариотического генома 41

1.3.2. Хроматин 45

1.3.3. Роль ДНК-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина 55

Глава 2. РЕАЛИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ ПРИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ 60

2.1. Транскрипция 61

2.1.1. ДНК-зависимые РНК-полимеразы 62

2.1.2. Единицы транскрипции (транскриптоны) 72

2.1.3. Этапы транскрипции 79

2.1.4. Хроматин во время транскрипции 112

2.2. Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации РНК 124

2.2.1. Процессинг РНК у бактерий 125

2.2.2. Редактирование пре-мРНК 131

2.2.3. Другие модификации эукариотических мРНК 143

2.2.4. Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов РНК-полимеразы II 163

2.3. Функциональная компартментализация ядра 168

2.3.1. Интерфазные хромосомы в ядре 169

2.3.2. Ядрышко 171

2.3.3. Пространственная организация синтеза мРНК 173

2.3.4. Ядерные тельца и домены 176

2.3.5. Компартментализованное ядро 178

2.4. Биосинтез белка рибосомами бактерий 180

2.4.1. Рибосомы 181

2.4.2. Этапы биосинтеза белка 187

2.4.3. Антибиотики, действующие на уровне трансляции 197

2.5. Трансляция у эукариот 200

2.5.1. Особенности первичной структуры эукариотических мРНК 201

2.5.2. Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами 202

2.5.3. Элонгация полипептидных цепей 212

2.5.4. Терминация трансляции 213

2.5.5. Трансляция в митохондриях 215

2.5.6. Трансляция в хлоропластах. 219

Глава 3. ОСНОВНЫЕ ПУТИ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ 223

3.1. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот 225

3.1.1. Регуляция на уровне инициации транскрипции 225

3.1.2. Регуляция синтеза РНК на уровне элонгации и терминации 229

3.2. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот 238

3.2.1. Передача сигнала и вторичные мессенджеры 240

3.2.2. Механизмы позитивной регуляции транскрипции 260

3.2.3. Механизмы негативной регуляции транскрипции 296

3.2.4. Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов 303

3.2.5. Импринтинг 317

3.2.6. Метилирование ДНК в регуляции транскрипции 318

3.3. Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов 329

3.3.1. Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРНК 329

3.3.2. Сплайсинг РНК в регуляции экспрессии генов 342

3.3.3. Избирательная деградация мРНК 352

3.4. Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции 357

3.4.1. Регуляция инициации трансляции 357

3.4.2. Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей 366

3.4.3. Регуляция терминации трансляции 369

3.5. Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина 370

3.6. Посттрансляционная регуляция экспрессии генов 372

3.6.1. Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей 372

3.6.2. Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков 375

3.6.3. Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков 376

3.6.4. Сплайсинг белков 380

3.6.5. Другие посттрансляционные модификации белков 385

Глава 4. ВОСПРОИЗВЕДЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ 389

4.1. Репликация ДНК 389

4.1.1. Белки, участвующие в репликации ДНК 390

4.1.2. Репликативная вилка E. coli и бактериофага T4 393

4.1.3. Особенности функционирования репликативной вилки эукариот 399

4.2. Регуляция репликации ДНК 402

4.2.1. Инициация репликации ДНК у E. coli и ее регуляция 404

4.2.2. Регуляция репликации плазмиды ColE1 413

4.3. Особенности репликации линейных геномов 420

4.3.1. Линейные хромосомы бактерий 421

4.3.2. Репликаторы эукариот 424

4.3.3. Репликация теломерных участков эукариотических хромосом 426

4.3.4. Пространственная организация синтеза ДНК у эукариот 428

Глава 5. ЗАЩИТА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ 431

5.1. Мутации 432

5.1.1. Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности 434

5.1.2. SOS-мутагенез у бактерий 448

5.1.3. Мутаторный фенотип 452

5.1.4. Экспансия ДНК 455

5.1.5. Адаптивные мутации 459

5.1.6. Механизмы защиты генома от мутаций 463

5.2. Репарация ДНК 464

5.2.1. Основные механизмы репарации поврежденной ДНК 465

5.2.2. Эксцизионная репарация в клетках животных 467

5.2.3. Гомологичная рекомбинация в репарации ДНК 480

5.2.4. Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов 482

5.2.5. Полимераза поли(ADP-рибозы) в репарации ДНК у эукариот 485

5.3. Альтруистичная ДНК 489

5.3.1. Парадокс возможности существования многоклеточных организмов 491

5.3.2. Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями 494

5.3.3. Селективная защита генов от мутаций 499

5.3.4. Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах 507

5.3.5. Возможный смысл парадокса С 515

Глава 6. СОВРЕМЕННАЯ КОНЦЕПЦИЯ ГЕНА 521

ЧАСТЬ II. ИСКУССТВЕННЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ 530

Глава 7. ПРИНЦИПЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ 531

7.1. Основные ферменты, используемые в генной инженерии 538

7.1.1. Рестриктазы и ДНК-метилазы 538

7.1.2. ДНК- и РНК-лигазы 547

7.1.3. Ферменты матричного синтеза ДНК и РНК 548

7.1.4. Другие ферменты 555

7.2. Векторы 557

7.2.1. Плазмидные векторы 558

7.2.2. Векторы на основе фага  562

7.2.3. Космиды и фазмиды 567

7.2.4. Сверхъемкие векторы YAC, BAC и PAC 569

7.2.5. Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы 573

7.2.6. Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование 576

7.2.7. Векторы для переноса ДНК в клетки животных и растений 591

7.3. Клонотеки генов 594

7.3.1. Получение клонотек генов 595

7.3.2. Введение рекомбинантных ДНК в клетки 597

7.3.3. Методы скрининга клонотек генов 599

7.4. Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток 601

7.4.1. Клетки яичников китайских хомячков (линия CHO) 603

7.4.2. Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0) 605

7.4.3. Клетки селезенки мышей (линия MEL) 607

7.4.4. Клетки африканской зеленой мартышки (линия COS) 608

7.4.5. Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами 609

7.4.6. Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии 610

7.5. Бесклеточные белоксинтезирующие системы 611

7.5.1. Прокариотические системы 613

7.5.2. Эукариотические системы 616

7.5.3. Проточные системы 618

7.6. Другие современные методы исследования генов 619

7.6.1. Рестрикционное картирование генов 619

7.6.2. "Прогулки и прыжки по хромосомам" 621

7.6.3. S1-картирование РНК и ДНК 623

7.6.4. Футпринтинг 624

7.7. Стратегия выделения нового гена 625

Глава 8. НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ И БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ 628

8.1. Методы направленного получения мутаций 629

8.1.1. Получение делеций и вставок 629

8.1.2. Химический мутагенез 632

8.1.3. Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов 634

8.1.4. Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе 641

8.2. Белковая инженерия 645

8.2.1. Библиотеки пептидов и эпитопов 645

8.2.2. Белки-репортеры в гибридных белках 654

8.2.3. Гибридные токсины 655

8.2.4. Подходы к созданию новых ферментов 661

8.2.5. Субтилигаза в лигировании пептидов 665

8.3. Концепция ксенобиоза 669

Глава 9. АНТИСМЫСЛОВЫЕ РНК, РИБОЗИМЫ И ДЕЗОКСИРИБОЗИМЫ 678

9.1. Антисмысловые РНК и олигонуклеотиды 678

9.1.1. Механизм действия антисмысловых РНК 679

9.1.2. Использование антисмысловых РНК 681

9.1.3. Природные антисмысловые РНК 686

9.1.4. Антисмысловые РНК и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций 689

9.2. Рибозимы и дезоксирибозимы 691

9.2.1. Типы рибозимов 691

9.2.2. Свойства рибозимов 693

9.2.3. Рибозимы как лекарственные средства 697

9.2.4. Репарация мутантных РНК с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг 703

9.2.5. Дезоксирибозимы 707

9.3. Аптамеры 709

9.4. Молекулы РНК у истоков жизни 712

9.4.1. Молекулы РНК в качестве РНК-репликаз 713

9.4.2. Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами РНК 716

Глава 10. ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ И РАСТЕНИЯ 721

10.1. Способы получения трансгенных многоклеточных организмов 721

10.2. Экспрессия трансгенов 724

10.3. Использование трансгенов у животных 725

10.3.1. Исследование механизмов экспрессии генов 726

10.3.2. Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе 727

10.3.3. Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных 728

10.3.4. Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека 731

10.4. Трансгенные растения 734

10.5. Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний 736

10.5.1. Способы доставки новых генов в геном человека 737

10.5.2. Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях 743

10.5.3. Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний 745

10.5.4. Ближайшие перспективы использования генотерапии 749

10.5.5. Успехи генотерапии в модельных экспериментах 751

10.5.6. Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии 752

Глава 11. ДНК-ДИАГНОСТИКА И ДНК-ТИПИРОВАНИЕ 754

11.1. ДНК-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний 758

11.1.1. Получение клинического генетического материала 758

11.1.2. Диагностика заболеваний 760

11.2. ДНК-типирование 773

11.2.1. ДНК-типирование микроорганизмов 774

11.2.2. Идентификация личности на основе минисателлитной ДНК: определение отцовства 777

11.3. Микроматрицы и микрочипы ДНК 786

11.3.1. Методы создания микроматриц ДНК 787

11.3.2. Ограничения в использовании микроматриц ДНК 790

11.3.3. Использование микроматриц ДНК в фундаментальных и прикладных исследованиях 792

Глава 12. КАРТИРОВАНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА 796

12.1. Основные подходы к картированию генома человека 796

12.1.1. Генетические карты сцепления 797

12.1.2. ПЦР в исследованиях генома человека 802

12.1.3. Физические карты низкого разрешения 804

12.1.4. Физические карты высокого разрешения 807

12.2. Определение полной первичной структуры ДНК генома человека 809

12.3. Базы данных получаемой информации 810

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 813

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 818

Предисловие редактора

Сей факт с сияющим лицом

Вношу как ценный вклад в науку.

Саша Черный

Науку двигают методы и увенчивают теории. Концептуальные прорывы 1950–1960-х годов – прежде всего, двойная спираль, генетический код и механизм биосинтеза белка – легли в основу молекулярной биологии и молекулярной генетики. Этот начальный период бури и натиска завершился химико-ферментативным синтезом структурного гена аланиновой тРНК дрожжей – событием, которое далеко не все тогда оценили по достоинству. Для скудных методических возможностей того времени это был феноменальный coupdeforce, потребовавший пятилетних усилий группы высококвалифицированных химиков и биохимиков под руководством Гобинда Кораны, чтобы быть выполненным, и целого номера "JournalofMolecularBiology", чтобы быть описанным. Шокированный последним обстоятельством, журнал "NatureNewBiology" устами своего рецензента заявил: «Подобно проекту “Аполлон”, все это сделано лишь для того чтобы показать, что это можно сделать, и, как и этот проект, никогда не будет повторено». Редко случается, чтобы пророчество оказалось настолько бездарным: последующие годы принесли сотни искусственных синтезов такого рода, причем во многих из них использовались основополагающие разработки Кораны. Протагонистом противоположной точки зрения явился Артур Корнберг, который сказал, обращаясь к Коране: “То, что Вы сделали, – это атомная бомба 1980 года”.

Первый синтез гена явился предшественником растянутого во времени большого методического взрыва 1970–1980-х годов в молекулярной биологии. К самым ярким вехам этого взрыва, наряду с олигонуклеотидным синтезом (с переходом его от искусства к ремеслу), можно отнести эндонуклеазы рестрикции, молекулярное клонирование, секвенирование нуклеиновых кислот и полимеразную цепную реакцию. В сочетании с многими другими находками, перечислить которые невозможно, это сделало молекулярную биологию методически почти всемогущей. Будущее покажет, достаточно ли этого, чтобы сбросить покровы с тайны живого.

Бурный поток оригинальных публикаций делает особенно важным жанр обзора в различных его видах. Книга – сложнейший из них, хотя современные возможности работы с литературой далеко отодвинули пределы осуществимого в этой области. Л.И. Патрушев поставил перед собой трудную задачу в одиночку охватить значительную часть современного массива достижений и перспектив молекулярной и клеточной биологии, непосредственно связанную с нуклеиновыми кислотами. На этом пути он сумел сделать удивительно много. Достаточно просмотреть оглавление, чтобы убедиться, что в книге не оставлены без внимания почти все основные направления, имеющие прямое отношение к нуклеиновым кислотам. При этом использован новейший материал, включая множество данных, опубликованных в этом году. Работа не прекращалась ни на минуту, и даже последние числа минувшего октября были свидетелями рождения новых разделов. В результате создано большое молекулярно-биологическое полотно, в котором каждый – от студента до (как это ни кощунственно) академика – может найти для себя что-то неожиданное.

По способу изложения материала квалифицировать книгу непросто. Ее не назовешь учебником в строгом смысле слова, хотя систематичность и внутренняя логика несомненны. Нередко от читателя требуется солидная подготовка, способность истолковывать аллюзии и проскакивать над эллипсисами. Зато удовлетворение от проникновения в материал очень велико.

Эта книга – не просто крупномасштабная компиляция. На ней отчетливо видна печать личности автора. Чувствуется, как небезразлично ему все то, что вот уже несколько десятилетий происходит на огромном пространстве молекулярной биологии. Многое ему удалось превосходно, хотя подстерегающие на этом пути тернии пристрастия, в частности несбалансированной нежности к порождениям собственного разума, не всегда увиты лаврами. В то же время, именно таков путь к звездам единой точки зрения, может быть, даже всеохватывающей концепции – в определенном смысле аналога единой теории поля, мысли о которой когда-то превратили в интеллектуальную трагедию закат великого физика.

Предлагаемая книга – плод эрудиции, вдохновения и самоотверженного труда Л.И. Патрушева и тех, чьи мысли и дела он цитирует, обсуждает, превозносит или критикует, – несомненно найдет множество благодарных читателей.

Ю. Берлин

Ноябрь 1999 г.